法医学精斑检验方法新进展

程媛媛 李 树

（中国刑事警察学院 辽宁·沈阳 110035）

精斑是精液射出于体外后浸润或附着于某些载体上随时间变化逐渐干燥形成的一类生物斑痕斑迹。

传统检验方法有光谱法、酶催化法、化学法和传统免疫学法等。光谱法包括交替光源照射法、拉曼光谱法等；酶催化法包括酸性磷酸酶检验、乳酸脱氢酶试验等；化学法包括苦味酸结晶试验和碘化钾结晶试验等；传统免疫学法有前列腺特异性抗原检测。这些方法操作简便，但方法灵敏度和特异性有限，对检材完整性要求高，检验结果不稳定且影响后续DNA检测。

现代的精斑检验方法主要分为生物化学方法和分子生物学方法。

1 生物化学方法

1.1 免疫荧光染色和激光显微切割技术检测

目前大多对精子的可视化方法是基于组织学染色，但这些方法对精子并不特异，而且染色会导致DNA损伤。2009年Vandewoestyne等发现一种新的精子染色方法，即使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚等对精子头部进行特异性免疫荧光染色，经室温自然干燥后，使用激光显微切割技术（laser capture microdissection，LCM）切割并捕获荧光标记的精子。该技术是目前最先进、自动化程度最高的组织纯化病理技术，可以精确分离精子和阴道上皮细胞。基于该检测技术目前已研发出成品试剂盒，如Hy-LiterTMPI试剂盒。但是该方法切割精子过程易受设备功率、环境湿度和温度以及精子细胞的数量等因素影响。

1.2 精液蛋白质质谱技术检测

传统的蛋白质组学研究主要是通过双向电泳技术，在检测亲脂性蛋白质、相对分子质量过大或过小和微量蛋白上效果不理想。二维微量高效液相系统(2D-HPLC)、多维蛋白鉴定技术的发展解决了传统方法的局限性，在不破坏DNA结构和节约样本的基础上，可以识别混合物中的特定成分，已应用在唾液和精液检测。精斑检测主要利用精子表面蛋白质质谱、精浆蛋白质质谱和差异蛋白质质谱等进行检测。2013年Yang等用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪检测出48个精液特有蛋白，如精囊蛋白（SEMG1/2）、PSA、前列腺磷酸酶（SAP）、半胱氨酸分泌蛋白等。但是部分蛋白质，如SEMG2等，不存在于无精症患者的精液中，不适用该方法。

1.3 免疫磁珠法检测

通过将特异性的抗体与磁珠进行结合，利用磁性分离技术达到对精液和阴道分泌液混合斑中精子进行捕获和检测。目前，精子特异性抗原对应的单克隆抗体及多克隆抗体的免疫磁珠结合的技术发展也已经很成熟。2011年国内学者利用抗 SPAG8抗体和人精子鱼精蛋白抗体成功对精子细胞进行的捕获和分离。免疫磁珠法具备了抗原抗体的较高特异性和其本身的固化性等优点，具有较好的法医物证学进行精斑检验的应用前景。

2 分子生物学方法

精斑的确证检验和个人识别广泛应用分子生物学方法。其中mRNA、miRNA、DNA甲基化应用于精斑的确证检验，Y染色体遗传标记（Y-STR和Y-SNP）应用于精斑的个人识别。

2.1 精斑的确证检验

2.1.1 mRNA检测

理论上，由于基因的选择性表达，通过特定基因的mRNA表达进行检测，获得mRNA的表达谱，就可确证相应体液的存在。KLK3和PRM2基因分别在前列腺组织细胞和精子细胞中呈现高水平表达，而在其他组织器官中不表达或少有表达，具有特异性。根据这两个基因的表达情况，可建立通过检测特异性 mRNA标记进行精斑检测的方法及标准。该方法具有操作简便、快速，灵敏度高、特异性强等优点，但其与DNA分型技术不兼容。此外，由于RNA不稳定，所以阴性结果也不能排除有精子存在的可能性。

2.1.2 miRNA检测

MicroRNA（miRNA）是一类真核生物体内内源性小分子的单链RNA，长度约为18-25nt，它能通过与靶mRNA碱基配对引起靶mRNA降解或抑制其翻译，从而进行基因表达调控。2009年Hanson等研究发现miR10b和miR135b在精斑中的表达量高于其他体液斑迹，而且在有月经血痕的混合斑和阴道拭子中也有较高水平的表达，可用于精斑确证检验。由于miRNA碱基序列很短，适用于陈旧、易降解的生物检材的检测。但该方法存在miRNA实时荧光定量PCR体系的假阳性率和假阴性率高，耗材昂贵，且与DNA分型技术不兼容等局限性。

2.1.3 DNA甲基化检测

DNA甲基化主要见于CpG二核苷酸的胞嘧啶上，其检测一般在 CpG二核苷酸相对集中的区域。众多表观遗传学研究表明，通过利用人类基因组中组织特异性DNA甲基化的差异位点（tDMRs)可以对检材来源进行鉴别。2013年AdamWasserstrom等将5个具有精液特异性甲基化差异位点和3个附加作为内部参照位点联合起来，研发出第一个将tDMRs作为鉴定依据对人体组织或体液样本进行精液斑识别的试剂盒，该方法类似于DNA分型技术。2012年刘峰等采用DNAIQTMSystem试剂盒成功检验了1例精斑。现阶段各类研究筛选的位点数量有限、相关甲基化差异的多态性不高，远不能满足法医实践中识别生物斑迹类别的需要。因此，未来需筛选更多适用于各种体液鉴定的DNA甲基化差异性标记。

2.2 精斑的个人识别

在法医学中，精斑及混合斑个人识别检验常用Y染色体遗传标记，包括Y-STR和Y-SNP。此外，新一代测序技术日渐成熟，是目前精斑检验的研究方向和重点。

2.2.1 Y-STR检测

Y-STR在强奸案、轮奸案的混合斑及少精子或无精子的混合斑中男性个体DNA检测具有重要作用。当混合斑中男性精子远低于女性阴道上皮细胞成分时(比例为1:25～1:50)，以及精液样本存放时间过长、精子拷贝数低、检材发生污染或降解时，Y-STR检测可以排除这些因素对分型结果的影响。1999年Honda等利用4个特异的Y-STR位点，对保存长达25年之久的阴道拭子混合斑检材进行了检测，成功发现了罪犯。在轮奸案中，可利用分型结果一个基因座出现的等位基因个数推知最少作案人数，为案件的侦查提供线索。有研究报道，使用Y-STR检测到多个男性成分的可能性大约是只使用常染色体STR检测的三倍。

2.2.2 Y-SNP检测

Y-SNP位点在人类基因组中分布广泛，数目约比Y-STR位点要高出几个数量级。研究发现，30～60个Y-SNP位点即能达到目前使用的Y-STR位点复合扩增系统的识别率。YSNP位点主要用于族源推断，还可用于个体识别。Y-SNP检验手段主要有多重单碱基延伸SNP分型技术(SNaPshot)、飞行时间质谱技术(MassArray)，中高通量的SNPstream芯片技术和高通量的二代测序技术(NGS)等。有研究通过DNA微阵列进行SNP分型，发展了Y-SNP芯片，可用于混合斑及精斑的鉴定。但是目前多个Y-SNP位点的检测体系仍在探索中，在日常检测中有局限。

2.2.3 新一代测序技术

DNA测序技术可以检测遗传标记的结构，直观而全面地展示核酸的深层次分子生物学信息。在混合斑及精斑检验中，利用二代测序对混合DNA进行STR基因座和SNP位点综合测序，通过长度多态性和序列多态性，进而推断混合DNA不同个体来源以及轮奸案中最少作案人数。二代测序技术在过去的二十年里发展迅速，并逐步实现了商业化。二代测序有高通量和成本低等优势，但测序读长较短，且相较于一代测序而言，二代测序时间长。因此，测序读长长、时间短的三代测序应运而生，其不依赖于PCR扩增技术，为单分子测序。市面上三代测序平台有美国 Heliscope BioScience公司的SMS技术和美国Pacific Bioscience的SMRT技术，VisiGenBiotechnologies公司的FRET技术以及英国ONT公司所推出的纳米孔单分子测序技术。

3 展望

在性犯罪案件中，精斑作为法医实践中常见的生物物证检材，其检验结果可以为侦查提供线索，为诉讼提供证据。随着技术发展，二代测序的应用成为未来精斑个人识别技术发展的新趋势。虽然现在有很多精斑鉴别新技术，但还传统检测方法辅助和大量试验。