组蛋白去乙酰化酶调控软骨细胞终末分化的机制

许博洋，王可欣，金宇，王驰宇，郭义，8，9

1.天津中医药大学针灸推拿学院，天津301617；2.北京大学运动医学研究所，北京100191；3.北京市运动医学关节伤病重点实验室，北京100191；4.天津中医药大学中药制药工程学院，天津301617；5.云南中医药大学中药学院，云南昆明650500；6.天津中医药大学中医学院，天津301617；7.美国南加州大学伯克利分校工程学院电子工程与计算机科学系，加利福尼亚州CA 94720-1776；8.天津中医药大学实验针灸学研究中心，天津301617；9.国家中医针灸临床医学研究中心，天津300381

前言

软骨细胞终末分化时发生的DNA甲基化与转录后组蛋白乙酰化协同作用失常所引起的表观遗传学改变是多种骨关节疾病的病理基础，其本质是染色质基本结构亚基核小体的异常。核小体由DNA盘绕组蛋白八聚体形成。组蛋白是构成软骨细胞核染色质基本组分的一类碱性蛋白质，含有较多的赖氨酸结合位点，易被乙酰化修饰［1-2］。组蛋白去乙酰化酶（Histone Deacetylase,HDAC）和组蛋白乙酰化转移酶（Histone Acetyltransferase,HAT）分别调控组蛋白的去乙酰化和乙酰化过程，从而通过影响染色质构象调节基因的转录过程，保持正常软骨细胞生理功能始终处于动态平衡稳定状态［3-4］。根据HDAC的分子具象和催化机制可分为I、II、III、IV型，其中由于组织分布的特异性可将II型细化为IIa（包括HDAC4,5,7,9）和IIb（HDAC6,10）两个亚型。从目前的遗传学研究来看，HDAC4和HDAC6可在软骨组织中表达，并能够感受多种外界刺激进而参与调节软骨细胞的生长发育过程。另外，机械因素在软骨组织发生发展的全过程中均承担着重要作用，HDAC4和HDAC6同时作为一种应力敏感型受体可为异常机械载荷作用下的软骨损伤机制提供一定的合理解释。但目前关于HDAC6介导软骨损伤具体机制的研究不多，仅发现其可通过机械载荷介导初级纤毛的适应性变化［5-6］以及抑制成纤维细胞生长因子受体-3的积累在软骨内成骨中发挥作用［7］。本文将就近年来有关HDAC4在软骨组织终末分化的生理病理机制的相关研究进行综述，以期为骨科临床和软骨组织工程应用提供一定理论依据。

1 软骨形成及终末分化

透明软骨组织分布较为广泛，分为暂时性和永久性两个类别阶段。暂时性透明软骨常见于骨骼发育的早期，胚胎期间充质干细胞Y型连续凝结形成软骨间叶原基，间叶原基软骨细胞随软骨生长板的软骨内骨化过程而逐渐消失，逐渐被骨组织取代，丧失原有功能。永久性透明软骨由关节腔周围间带细胞分化而来的软骨细胞构成［8-9］，因此主要见于滑膜关节表面。目前通过单细胞RNA测序分析技术可得出7种软骨细胞类型——效应性软骨细胞、调节性软骨细胞、稳态性软骨细胞、增殖性软骨细胞、纤维性软骨细胞、前肥大软骨细胞（Prehypertrophic Chondrocytes,preHTC）和肥大软骨细胞（Hypertrophic Chondrocyte,HTC）［10］。一般正常成熟软骨组织只含有前3种软骨细胞亚型，不进行后4种逐级演变的终末分化行为。不同于可逆的未干预阶段关节祖细胞定向分化过程，终末分化不可逆转。当软骨组织由于炎症或高强度机械载荷长时间加载引起损伤时，软骨细胞将丧失分化表型，获得肥大样改变，最终导致凋亡钙化。X型胶原蛋白（Collagen type X,Col X）和基质金属蛋白酶-13（Matrix Metalloproteinase-13,MMP-13）是HTC主要表达的细胞因子，所以也可作为软骨细胞终末分化表型改变的生物学标志物，且与关节软骨钙盐沉积密切相关。HDAC4则主要定位表达于前肥大软骨细胞中，在敲除HDAC4基因之后的小鼠将表现为软骨细胞的异常肥大，以及发育成熟前异常的软骨内骨化［11］。因此，HDAC4可能是软骨损伤发病机制中潜在的治疗靶点，且与多种细胞转录因子信号级联。

2 机械应力介导核穿梭机制

HDAC4在软骨细胞核内外的穿梭移动机制是其发挥细胞调控作用的基础［12］。在正常软骨组织生长发育情况下，HDAC4定位活化于增殖区软骨细胞的细胞核，可促进软骨细胞增殖，抑制分化；而在多种调节途径作用下HDAC4丧失酶活性在体内重新定位于成熟区或肥大前期软骨细胞的细胞质，引起软骨细胞的肥大化［13］。HDAC4主导入核和出核的两个功能结构域分别位于N端和C端，N端包含入核序列，受磷酸酶调控，可感受Ca2+信号变化；C端包含出核序列，可受多种磷酸激酶调控。另外，胞质中处于静息状态下的HDAC4依赖于14-3-3伴侣蛋白的生物学功能，14-3-3通过与HDAC4N端磷酸化的丝氨酸残基结合，掩盖了入核序列，使其滞留于细胞质，间接促进软骨细胞终末分化。现有研究发现机械应力可介导HDAC4核穿梭机制，其调节软骨细胞终末分化的分子生物学基础是蛋白磷酸酶2A（Protein Phosphatase 2A,PP2A）的激活与否［14］。机械应力能够激活PP2A，使HDAC4的多个丝氨酸残基结合位点去磷酸化，N端入核序列被激活，引导HDAC4入核，C端Zn+催化结构域与辅阻遏物复合体特异性结合，此时HDAC4具备酶活性，移除组蛋白的乙酰基团并抑制DNA转录，同时活化的HDAC4与相关细胞因子级联，抑制软骨细胞终末分化。但值得注意的是，HDAC4并不能直接以靶向结合的方式干预DNA的特异性序列，而只能通过影响DNA转录信号因子的途径间接发挥作用［15］。

3 HDAC级联调控信号因子

软骨细胞肥大的调控并不局限于单一的转录因子，而是被一个调控网络所控制，许多转录因子已经被证明参与软骨细胞终末分化的过程，如Runx转录因子、印度豪猪蛋白（Indian Hedgehog,Ihh）、MMPs、低氧诱导因子（Hypoxia Inducible Factor,HIF）、MicroRNAs以及信号转导和转录激活因子（Signal Transducer and Activator of Transcription,STATs）等。HDAC4作为软骨细胞肥大的中央调节物质，可感受多种细胞信号通路的影响，并级联下游转录因子［16-17］。另有研究提示，软骨细胞肥大化与骨的形成可能皆取决于肌细胞增强因子2C（Myocyte Enhancer Factor 2C,MEF2C）与HDAC4之间的平衡，其余大部分的转录因子都需要通过HDAC4-MEF2C轴从而参与调控软骨细胞增殖以及分化的过程中，当MEF2C表达缺失时，部分转录因子的表达水平也有所影响［18-19］。

3.1 核心结合因子α1

Runx转录因子又称核心结合因子，是细胞发育途径中特异性基因表达的关键调控因子，其包含高度保守的Runt同源域，在转录水平上受到远端P1和近端P2两个启动子的调控［20］。Runt家族可分为Runx1、Runx2和Runx3三类，其中Runx2对于软骨细胞的增殖分化和肥大成熟至关重要［21］。Runx2在软骨细胞进入肥大阶段时，能够通过诱导Ihh、MMP-13和Col X的表达，显著增快软骨细胞终末分化进程。HDAC4在preHTC中表达，通过与Runx2的直接交互作用并以剂量依赖性的方式促进Runx2降解或抑制其活性，从而抑制软骨细胞肥大，减少骨赘形成和软骨损伤，增加关节软骨的合成和代谢［22］。另有研究发现，转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-β,TGF-β）可以通过信号转导蛋白Smad3募集HDAC4并与Runx2形成复合体的功能方式来抑制成骨细胞分化［23］。除此之外，TGF-β诱导因子2（TGFβ-Induced Factor 2,TGIF2）作为维持细胞功能稳态以及调控骨质流失的关键激活因子也可以通过促进HDAC4表达进一步加强对Runx2的抑制，TGIF2的过表达显著抑制成骨的分化过程［24-25］。Lawson等［26］实验发现组蛋白甲基转移酶可以协同HDAC4抑制Runx2的活性，通过阻止软骨细胞的终末分化，在维持关节软骨正常结构功能中起着至关重要的作用。在感受循环拉伸应力（Cyclical Tensile Strain, CTS）后，HDAC4 穿核表达，Runx2、MMP-13和Ihh的表达减少，从而抑制软骨细胞的异常增殖分化以及肥大基因的表达。因此，在骨关节炎（Osteoarthritis,OA）的异常生物力学环境下会影响HDAC4的核穿梭过程，减少对其他转录因子的影响，加重病情。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）信号转导作为OA发生发展过程中的调控炎症下游通路之一，可通过增加天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的表达，裂解HDAC4，大量释放Runx2，引起软骨细胞凋亡［27］。

3.2 MicroRNAs

MicroRNA（miRNA）是一类高度保守的内源性非蛋白质编码RNA，长度约为18～25个核苷酸，类型较多，可与mRNA结合调控其功能［28-29］。目前仅发现miR-1、miR-27a/b、miR-138、miR-140、miR-222 和miR-365 参与软骨细胞终末分化过程。其中miR-27a/b、miR-365和miR-140为机械敏感型miRNA，HDAC4是它们的直接靶标，可直接感受机械刺激从而影响HDAC4的表达。实验研究证明，大多数miRNA的过表达都会对HDAC4的入核过程有所抑制。miR-1 通过抑制HDAC4 增强Runx2的表达，促进软骨细胞分化［30］。miR-365是介导机械应力和炎症的关键调节因子，miR-365 的过表达会显著抑制HDAC4，影响软骨细胞的分化进程［31-32］。进而上调软骨细胞终末分化生物学标志物MMP-13的表达，通过Runx2和MEF2促进炎症细胞因子的产生，诱发OA。因此，在机械过载诱发的OA 软骨细胞中，miR-365的表达明显高于正常细胞［33］。同时除了对miR-365 的直接影响外，过度的机械刺激也会影响终板软骨细胞机械敏感型环状RNA（circRNA-0058097），通过海绵吸附miR-365a-5p 调节HDAC4 表达，促进终板软骨细胞的张力诱导变性，增加细胞外基质降解，促进软骨细胞退化，而抑制circRNA-0058097 则可有效增强终板软骨细胞的应力抗性［34］。因此，可以凭借miR-365的生物学作用，为骨髓间充质干细胞的定向分化提供思路。有研究证实在CTS 刺激下，通过促进miR-365在骨髓间充质干细胞中的表达，可以直接抑制HDAC4的活性，进而增强骨髓来源间充质干细胞增殖分化能力，有利于软骨形成［35］。循环静水压作为软骨细胞代谢的调节剂，可通过诱导Wnt/β-catenin 信号通路调节某些miRNA的水平，可以使细胞内miR-140表达有所上调，miR-27a/b 表达恢复至正常水平，对细胞中胶原蛋白及骨架蛋白等合成均有影响，导致OA 软骨细胞中MMP-13水平有所下调［36］。此外，也存在miRNA促进HDAC4入核过程的情况。在类风湿性关节炎中，显著上调的miR-138可对HDAC4进行负调控，凭借激活NF-κB信号转导参与成纤维细胞样滑膜细胞释放类风湿相关炎症因子的病理过程［37］。根据miRNA分析，OA软骨细胞中miR-222显著下调，证实miR-222过表达将通过下调HDAC4和MMP13水平，明显抑制软骨细胞凋亡［38］。

3.3 印猬蛋白-甲状旁腺激素相关肽信号轴

甲状旁腺激素相关肽（Parathyroid Hormone-related Peptide,PTHrP）可结合表达于preHTC的PTH1型受体，促进软骨细胞增殖以及抑制终末分化，是软骨生长板的关键调节剂［39-40］。PTHrP以软骨细胞中的HDAC4-MEF2c轴为媒介促进影响软骨细胞肥大过程，通过激活PP2A增强HDAC4对MEF2C转录因子的抑制作用，来抑制MEF2C转录因子的功能［41］。miR-140通过下调p38 MAPK 信号转导抑制MEF2C 的功能，从而增强PTHrP/HDAC4在软骨细胞肥大分化中的抑制作用［42］。在这一过程中，HDAC5 也参与到其对软骨细胞的调节［43］。另外，生理状态下机械应力可以调节PTHrP表达，但PTHrP/HDAC4机械转导过程仍待探究。Ihh由preHTC合成分泌，对软骨细胞的肥大和基质钙化起到重要的调节作用，在软骨生长板发育过程中，软骨细胞可增生、分化为柱状软骨细胞，进一步分化为肥大性软骨细胞［44-45］。在OA进程中可观察到Ihh被激活过表达现象。Ihh可以通过与Ptch1的结合介导Gli信号因子的表达从而调控PTHrP，间接调节毗邻的软骨细胞分化［46］。研究发现Ihh除了受miRNA及Runx2调控外，同时也会受到PTHrP的抑制作用，其对于Ihh表达产生负调控作用，防止细胞过渡到肥大前期［47-48］。但Ihh的过度抑制会导致细胞生长受到抑制，反而增加细胞凋亡［49］。因此，生长板中软骨细胞的正常增殖分化需依靠Ihh-PTHrP的反馈调节机制的积极介导。另有研究提出，甲状旁腺激素（Parathyroid Hormone,PTH）作为钙稳态的重要调节剂，可通过介导蛋白激酶A调节HDAC4磷酸化进而通过调节与Runx2 分离增强MMP-13 的表达［50-51］。PTH 还可以通过刺激miR-873-3p 上调降低HDAC4表达，增加MM-13启动子处与Runx2结合，减轻HDAC4对Runx2和MMP-13的抑制［52］。虽然目前仍并未见有机械载荷作用下PTH/PTHrP 协同作用影响HDAC4的报道，但我们猜测在机械载荷调控的不同生理病理情况中，PTH/PTHrP受体信号可经多条细胞信号通路调控软骨细胞的功能，如环磷酸腺苷/蛋白激酶A信号通路或磷脂酶C通路。

3.4 信号转导和转录激活子

STATs是细胞核磷酸化、甲基化及其他翻译修饰后的底物，可通过核质穿梭将来自于胞质的细胞信号传递给染色质，促进转录反应的正向或负向微调，在介导大多数细胞因子驱动的信号传导中有着至关重要的作用［53-55］。STATs 家族包括STAT1～4、STAT5a/5b 和STAT6［56］。STAT1与HDACs的联系较为紧密，其能够直接或间接参与细胞凋亡，STAT1调节生理信号的表达，影响细胞的生长分化凋亡等功能，HDACs能够动态调节STAT1乙酰化，而STAT1乙酰化后会抵消干扰素诱导的STAT1磷酸化，抵消其自身的活性［57］。其次，STAT1与STAT3之间能够相互激活，交叉调节［58］。但目前对于STATs与HDAC4二者间的具体调节关系及影响方式尚不明确。

4 总结

明确诱导软骨细胞表型改变的调节因子的分子生物学机制，有利于临床骨关节疾病的早期诊断及严重程度的评估。HDAC4作为软骨组织中的机械敏感型受体，目前其基因的转录调控机制较为冗杂，仍不清楚，充分研究其介导多种转录因子调节软骨细胞终末分化机制及其在此类过程中的作用对于骨骼和软骨细胞的发育至关重要。内源性骨形成以及生长板的过程大致与软骨细胞肥大样变化的途径类似，因此在软骨修复支架材料的工程应用中，HDAC4与其他转录因子的协同作用对于骨髓间充质干细胞定向分化以及软骨细胞形态调控也具有一定潜在意义。另外，随着年龄增长及OA的发生发展，关节软骨的自我保护机制——细胞自噬逐渐衰退，成为诱导细胞终末分化的原因之一，研究提示机械因素能够较好地调控软骨细胞自噬过程，但具体的生物物理学机制仍需进一步研究。