多发性骨髓瘤循环miRNAs的研究进展及应用

魏晓晶，邱录贵，郝 牧

多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）[1-2]是一种多发于中老年人群的单克隆浆细胞恶性增殖性疾病。临床表现变化大,从无症状到肿瘤细胞具有侵袭性,其临床表现是由于异常的免疫球蛋白沉积所致，包括高钙血症、肾功能不全、贫血和骨病(CRAB 症状)[3]。几乎所有MM[4]都是从相对良性的意义未明的单克隆免疫球蛋白血症(Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance,MGUS)发展而来。在过去的10 年中，由于新药的广泛使用[5]，如蛋白酶体抑制剂（硼替佐米）、免疫调节药物（来那度胺）、单克隆抗体和组蛋白乙酰化酶抑制剂等，极大地提高了MM 患者疗效并改善患者生存。目前，骨髓瘤仍然不能治愈，几乎所有患者均会复发、难治、甚至不治。在MM 发生发展以及治疗过程中，精准的预后分层、及时准确的疗效评估对临床诊治有着重要意义。

1 循环miRNA的来源及存在形式

1.1 miRNA定义及功能MiRNAs是一类18-24 个核苷酸的内源性单链非编码小RNA。MiRNA 通过与靶mRNA 的3′非编码区(3′-UTR)结合，抑制靶mRNA 翻译和基因表达[6]，发挥内源性RNA 干扰作用，在转录后水平负调控靶基因表达。MiRNAs 表达具有高度的组织特异性，调控人类约60%的基因表达，广泛参与生理发育及疾病发生，在细胞增殖、分化、凋亡及代谢等方面均发挥重要作用[7]，并可作为致癌或抑癌基因参与肿瘤的发生发展。随着检测技术的进步，特别是高通量测序技术的应用，miRNA在各种肿瘤细胞的表达谱相继被报道。

1.2 循环miRNA 的来源 作为循环核酸的一种，循环miRNA 可稳定存在于外周血中。近些年，循环血液中miRNA 表达与肿瘤相关性的研究越来越多。这些循环miRNA 随循环系统到达机体的各个部位，是肿瘤发展、迁移的重要途径。基于外周血清、血浆检测具有创伤小、稳定性好、可短期反复多次检测等优点，外周血循环miRNA 成为理想的肿瘤标志物。循环miRNA 的来源主要有三种：①破裂的细胞或受损的组织被动释放；②经由外泌体主动分泌；③不被外泌体包裹，与RNA 结合蛋白结合被分泌。外周血中miRNA与肿瘤细胞内miRNA表达图谱并不完全匹配，肿瘤微环境中其他细胞，如基质细胞等也可分泌miRNA 进入血液循环，研究显示细胞释放miRNA 具有选择性。微环境对肿瘤细胞miRNA 释放有调控作用，但是其具体分子机制目前尚不清楚。

2 循环miRNA在MM诊断中的应用

2.1 MM患者血清游离miRNAs 基于外周血清、血浆检测具有创伤小、稳定性好、可短期反复多次检测等优点，外周血循环miRNA 成为理想的肿瘤标志物。目前公认的用于液体活检的小分子为循环肿瘤DNA、miRNAs、外泌体、循环游离DNA 等。越来越多的研究表明循环miRNAs 表达异常可作为MM 的诊断标志物。Jones 等[8]对MGUS 患者（n=15）、初诊MM 患者（NDMM，n=24）以及健康人（Healthy Donor，HDn=13）和非MM 患者（n=20）的血清RNA 进行small RNA 测序，筛选到三个与MM发生密切相关的miRNAs 分子：miR-720、miR-1308和miR-1246。研究显示高表达的miR-720 和低表达的miR-1308 可作为MM 和MGUS 的诊断标志物（AUC=0.9862）。MiR-1246 的高表达与miR-1308的低表达可以辅助鉴别MGUS 与MM（AUC=0.7250）。Qu 等[9]对9例NDMM 和7例HD 的血清标本进行测序，筛选出12 个差异miRNAs，对其中10个有显著差异的miRNAs进行扩大样本（NDMMn=40、HDn=20）的qPCR 验证，结果显示miR-483-5p在MM 患者血清中表达水平显著高于HD(AUC=0.745)。同时有研究发现，miR-202在MM 患者血清中高表达[10]，AUC 为0.711，敏感性和特异性分别为80.0%和60.0%。MiR-202 与MM 患者血清中的β2微球蛋白和κ 轻链的浓度呈正相关(r=0.366,P=0.0305；r=0.358,P=0.0348)。MiR-203[11]的表达在血液中始终与β2 微球蛋白、M 蛋白和球蛋白密切相关，非侵入性检测miR-203 的表达水平具有良好的诊断意义。Kubiczkova 等[12]发现与HD 相比，MGUS、NDMM 和复发多发性骨髓瘤(Relapsed Multiple Myeloma，RMM）中miR-744、miR-130a、miR-34a、let-7d 和let-7e 异常表达。多因素logistic回归分析显示，miR-34a 和let-7e 联合检测可鉴别MM与HD（敏感性为80.6%，特异性为86.7%），同时也可区分MGUS 与HD（敏感性为91.1%，特异性为96.7%）。此外，低水平的miR-744 和let-7e 与MM较短的总生存(Overall Survival,OS)和缓解期有关。我们团队也长期致力于MM 中miRNA 参与的疾病发生发展的机制[13]、新型miRNA 药物[14]及血清分子标志物的研究[15]，对7例NDMM 患者和5例HD的血清miRNA 进行基因芯片分析，通过扩大样本量（NDMMn=108，HDn=56）的qPCR 验证，发现miR-19a 和miR-4254 在MM 患者血清中表达明显降低。ROC 曲线分析显示miR-19a 联合miR-4254可用于MM 的诊断(其敏感性为91.7%，特异性为90.5%)。生存分析显示，血清miR-19a 的低表达与MM 患者较短的无进展生存和总生存密切相关，是MM患者独立的预后不良因素。骨病是MM常见的临床症状，多数患者以骨痛为首发症状，骨病严重程度影响患者生存质量和生存时间。循环miRNAs表达水平在一定程度上可以反应骨病的等级。Hao 等[16]发现血清miR-214 和miR-135 高表达与溶骨性病变的严重程度呈正相关，可作为MM 骨病的诊断工具。上述研究结果表明MM 患者血清循环miRNA 的表达谱与正常人存在明显差异，可作为MM诊断的生物标志物。

2.2 MM血清外泌体 外泌体是一种直径30～150 nm的包裹有遗传物质（DNA 和RNA）及蛋白质的磷脂双分子层囊泡。外泌体作为信息传递的载体，最终会将其携带的遗传物质释放到受体细胞中发挥其功能[17]。随着大型仪器的发展和应用，研究者们对外泌体有了更多新的认识和研究。由包括癌细胞在内的多种细胞类型分泌的外泌体可从外周血中分离出来，并已被证明是癌症疾病进展的有力标志物[18]。Manier[19]最先在156 例MM 患者中进行血清外泌体miRNAs 生物标志物的研究，结果表明，MM患者血清外泌体中miRNA 表达谱与正常人存在22个差异表达的miRNAs，其中两个miRNAs（let-7b 和miR-18a）与MM 的无进展生存(Progress Free Sur‐vival,PFS)和OS 显著相关，低表达let-7b 与miR-18a的MM 患者有较短的无进展生存期和总生存时间。外泌体来源的miRNAs[20]表达模式也可预测MM 患者对硼替佐米的耐药性。与对硼替佐米敏感的MM 患者相比，外泌体内miR-16-5p、miR-15a-5p、miR-20a-5p 和miR-17-5p 表达下调出现在对硼替佐米耐药患者血清中。血清[21]外泌体的miR-20a-5p、miR-103a-3p和miR-4505在MM、SMM和HD的血清中显著差异表达，而MM 患者血清中低表达let-7c-5p、miR-185-5p，高表达miR-4741（与SMM 患者或HD 相比）。浆细胞来源的外泌体miRNAs 辅助浆细胞的增殖。由于骨髓内恶性肿瘤细胞的快速增殖会导致骨髓产生缺氧的环境，耐缺氧的MM 细胞会产生更多的外泌体，外泌体miR-135b 也显著上调[22]。MiR-135b 直接抑制其靶因子缺氧诱导因子抑制因子（Factor-Iinhibiting Hypoxia Inducible Fac‐tor 1，FIH-1），通过HIF-FIH 信号通路在缺氧的条件下促进内皮血管的生成，从而为肿瘤细胞的增殖生存提供有利的环境。MM 患者血清差异miRNAs与血清外泌体差异miRNAs 的表达水平并不一致[23]且没有相关性。肿瘤浆细胞来源的外泌体[24]还参与到对MM 患者骨质的破坏过程并抑制成骨细胞的生成，因此，外泌体是一个亟待开发的囊泡，外泌体参与的疾病发生机制及功能需要更多的研究者探索。

3 循环miRNA 在MM 疗效评价、预后评估中的研究进展及应用

几乎所有MM患者均会复发、进展，在MM治疗过程中，精准的预后分层、及时准确的疗效评估对临床诊治有重要意义。循环miRNAs的表达水平一定程度上提示MM 患者的生存时间和预后。Roc‐ci[25]对54 例NDMM 血清miRNAs 测序后筛选出25个在20% MM 患者中可检测到的miRNAs，其中10个miRNAs 在234 例NDMM 血 清miRNAs 的qPCR实验中被证实有差异表达。血清低表达miR-25[25]提示患者有较短的PFS 和OS，低表达miR-16 则与MM 患者较短的OS 密切相关。对于符合移植条件的MM 患者，在经化疗药物治疗后应进行造血干细胞移植，减少MM 复发机率。有研究者对MM 患者初诊、完全缓解（Complete Remission，CR）时的血清miRNA 进行测序并通过qPCR 验证发现miR-16、miR-17、miR-19b、miR-20a 和miR-660 在患者初诊及经自体造血干细胞移植后CR 时差异表达，miR-19b 和miR-331 表达降低的患者[26]PFS 明显缩短(HR=5.3，P=0.033)。在移植后复发的患者血清中，miR-19b 表达水平进一步降低，表明循环miR-19b的表达水平可作为MM 治疗前，CR 时以及自体造血干细胞移植后复发的动态监测生物标志物，是理想的非侵入性检测指标之一。Park 等[27]研究结果显示，在早期复发患者循环血中，从诊断到自体移植前，miR-193a-5p 表达呈逐渐下降趋势，自体移植前ISS 分期和miR-193a-5p 的表达情况是独立预后因素，因此，循环miR-193a-5p可以作为是否适合移植的预后生物标志物。

MM 患者浆细胞中出现不同的遗传学异常也影响患者的预后。最常见的TP53 缺失是MM 患者的高危遗传学异常之一，患者OS 时间较短。遗传学异常往往伴有miRNAs 异常转录表达。Huang等[28]对12 例NDMM 以及8 例HD 进行测序筛选出6个差异表达的miRNAs：miR-148a、miR-181a、miR-20a、miR-221、miR-625 和miR-99b。随后在28 例HD 及12 例NDMM 患者中进行验证发现，miR-99b的高表达与t (4，14)染色体异位相关（P=0.029），而miR-221 的低表达与del(13q)相关（P=0.04），此外高表达的miR-20a 和miR-148a 与较短的无进展生存期相关。MiRNAs 参与调控MM 细胞对药物的敏感性[29]。Jung 等[30]对38 例接受来那度胺治疗后复发MM 患者外周血循环miRNA 表达谱进行了miRNA 芯片分析。结果显示miR-26a-5p、miR-29c-3p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-193a-5p 和miR-331-3p 在来那度胺治疗中从未获得缓解的RRMM患者较获得缓解之后复发的患者表达降低，这部分患者生存时间明显缩短。因此，这些miRNAs 可预测来那度胺和小剂量地塞米松对RRMM 的疗效。基于miRNAs的结果建立来那度胺联合地塞米松治疗反应预测模型[30]，该模型使用了两个miRNAs(miR-26a-5p 和miR-193a-5p)和5 个临床变量(细胞遗传学、ISS分期、血红蛋白、WBC和钙的浓度)组成的输入特征，在ROC 模型中AUC 为0.933，MM 患者可以根据这个模型较早的明确对来那度胺联合地塞米松的治疗反应情况。循环miRNAs可作为预测RRMM 患者治疗反应和预后的微创标记物。基于外周血的易获得性，循环miRNAs 可取代传统骨髓活检的侵入性肿瘤细胞检查。

4 循环miRNA应用于MM临床诊断的前景

近年来循环生物标志物研究取得了快速的进展，FDA 已批准多项循环肿瘤DNA 用于临床检查[31]。循环miRNA 检测代表肿瘤液体活检最前沿的无创检测技术，研发循环miRNA作为MM早期诊断、疗效和预后评估以及微小残留病的生物标记物具有较好的应用前景，但是在进入临床应用之前还需解决循环miRNA 检测技术的标准化。虽然miRNA 稳定存在于循环血清中，但目前尚无公认的miRNA 定量实验内参。与其他新兴技术的临床转化一样，循环miRNA 检测、分析方法和技术必须进行标准化。随着对循环miRNA 特异性、准确性和规范化检测方法等全面系统研究，循环miRNA有望成为MM 早期诊断、预后评估、微小残留病检测的小分子生物标志物。