小胶质细胞极化M1/M2表型在脑出血后继发性损伤中的作用

宋苏蒙， 王丽琨综述， 伍国锋审校

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指急性的、自发性的脑血管破裂，血液流出至大脑实质、脑室或者蛛网膜下腔的过程。脑出血具有高发病率、高死亡率及高病残率。脑出血后血肿的扩大及吸收会引起一系列的反应，即所谓的原发性脑损伤及继发性脑损伤。小胶质细胞是被认为最早对脑出血做出反应的非神经元细胞，对于清除血肿及破碎的细胞组织非常重要，但同时也是继发性颅脑损伤中炎症损伤的重要来源[1]。

大量研究认为，小胶质细胞被激活后有两种极化状态即M1表型和M2表型，不同极化的小胶质细胞起着损伤和保护的双重作用。这一双重作用的病理改变及具体作用机制尚不明确，大量研究表明可能和促炎与抗炎因子的释放有关[2]。本文综述了小胶质细胞极化过程相关的重要进展，特别是小胶质细胞极化后M1/M2 表型之间作用差异及相互转化的过程，并列举了几种通过改变小胶质细胞极化状态而治疗脑出血的药物。

1 小胶质细胞概述

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻细胞，其不同与神经外胚层细胞，它起源于原始的髓系细胞，主要来自卵黄囊原始巨噬细胞。在很早期经过原始血流进入中枢神经系统，分化成为成熟的小胶质细胞，促进中枢神经系统的发育及维持内环境的稳定，并对周围环境起监视作用[3]。激活后的小胶质细胞与巨噬细胞在形态上极其相似，一直以来都缺乏区别两者的特异性受体，最近的研究发现一种小胶质细胞的特异受体：腺嘌呤受体(P2Y12受体)，它是一种二磷酸腺苷/三磷酸腺苷(ADP/ATP)反应的G蛋白偶联受体，在小胶质静息状态下被发现，这也可以作为识别脑组织中的炎症区域的一种手段[4]。

2 小胶质细胞的极化

在一定环境的刺激下，小胶质细胞可以被激活为两种状态，分别为经典激活型(M1表型)和替代激活型(M2表型)，我们称这一过程为极化。极化所涉及的不同表型，具有不同的生理作用[5]。M1表型的小胶质细胞具有促炎作用，主要是由脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)诱导而来，并分泌产生大量促炎细胞因子，包括IFN-γ、肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、趋化因子(CCL2，CXCL9，CXCL10)、蛋白水解酶(血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)，一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)以及主要组织相容复合物Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ，MHC-Ⅱ)这些都属机体的防御要素。正常情况下激活的小胶质细胞有利于清除入侵的病原体及坏死的细胞，但是小胶质细胞一旦被过度激活，M1表型小胶质细胞将释放高水平的上述的炎症因子及神经毒素物质，导致不受控制的炎症反应，加重组织损伤和神经元死亡[2]。M2表型的小胶质细胞可以被IL-4/IL-3诱导，产生高水平的抗炎因子，如IL-10、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、糖皮质激素(Glucocorticoid，GC)，M2表型小胶质细胞目前被认为是一种保护细胞，分泌抗炎因子及上调神经保护因子[6]。有研究表明M2表型的小胶质细胞可以分为3个亚型：M2a、M2b和M2c，每种亚型刺激因子和标志物都不同。M2a亚型的标志物有IL-4和IL-13，它是小胶质细胞激活的第一个阶段，M2a亚型与 M1表型竞争精氨酸，作为一种抗炎小胶质细胞亚型。M2b亚型是小胶质细胞的混合活化状态，可产生促炎和抗炎细胞因子。M2c亚型可由IL-10触发，可以关闭小胶质细胞的免疫应答。不同极化的小胶质细胞所表达的表面标志物也不一样，常用的M1表型小胶质细胞标志物包括MHC-Ⅱ、CD16、CD32、CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2)、CD40等，M2表型的表面标志物为Ym1、CD206、CD68和 Arg1[7]。在动物脑出血模型实验中，在脑出血的前3 d，M1表型标志物CD16、CD32及iNOS表达明显上升，这表明M1表型小胶质细胞主要在急性期出现[8]。

3 极化的小胶质细胞在脑出血中的作用

3.1 M1表型小胶质细胞的作用 M1表型小胶质细胞可以认为是促炎细胞，激活后所释放高水平的促炎因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-1β，过度的炎症反应加重脑组织的水肿，是脑出血继发性损伤的重要来源?除了促炎因子，M1表型小胶质细胞分泌大量ROS以及蛋白水解酶，包括HO-1、MMPs、iNOS等。

脑出血后，发生M1表型极化的小胶质细胞分泌大量的活性氧(ROS)，作为炎症反应中重要成分，它既是反应的产物也是参与者，这一恶性循环反应过程称为呼吸爆发，通过激活NADPH氧化酶2(NOX 2)而介导[9]。ROS是一种活性很强寿命很短的分子，它包括超氧物、过氧化氢及羟基自由基。正常情况下ROS与抗氧化之间保持平衡，是细胞代谢及系统防御的重要组成部分，而在脑出血后，ROS的堆积使凋亡基因及炎症介质由低表达转为高表达状态，从而诱导细胞凋亡、破坏血脑屏障，这一过程称为氧化应激作用，是脑出血后继发性损伤机制的重要部分[10]。目前运用较为成熟的抗氧化剂依达拉奉，可清除氧自由基起到抗氧化作用，该药在临床上的运用已经证实可以明显改善缺血性脑卒中预后，但对于其在脑出血后的作用尚不明确，最近有试验研究表明，依达拉奉在脑出血后通过抑制小胶质细胞NF-κB依赖性NLRP 3起到神经保护作用，为依达拉奉应用于脑出血后的临床应用提供了新的证据[11]。

小胶质细胞M1表型极化后，血红素加氧酶(HO-1)大量产生。在胶原酶诱导小鼠脑出血动物模型中，脑出血后第1天，同侧纹状体内HO-1蛋白表达显著增加，第3天达高峰，第7天下降，实验结果显示，敲除HO-1基因对脑出血后早期脑功能有明显的保护作用，这种保护作用可能与诱导脑出血后早期和关键阶段小胶质细胞活化、白细胞浸润和ROS生成减少有关[12]。脑出血后血红蛋白在代谢的过程中释放大量游离的血红素，并进一步代谢为铁、一氧化碳及胆红素，而HO-1就是这一代谢过程的限速酶[13]。其中铁是多种细胞色素和依赖与氧化还原反应的蛋白质必不可缺少的辅助因子，大量的HO-1分泌后使铁在脑中聚集导致铁超载，导致脂质过氧化和自由基的形成，引起脑损伤和不可逆转的神经功能缺损。此外也有研究表明，铁聚集还可以进一步诱导活性氧的大量产生，可能是导致脑出血后水肿形成的直接原因[14]。然而，目前对HO-1在脑出血后的作用研究尚具有争议，现有研究认为，对于HO-1的作用存在双面性，使用HO-1诱导剂和HO-1抑制剂来研究其在脑出血过程中的作用，HO-1在脑出血早期加重了脑损伤，但是在晚期却可以增加血肿的吸收和促进血管的生成从而发挥神经保护作用[12]。所以，HO-1在脑出血后的作用不可单纯认为只有损伤作用，其在这一过程中作用是动态变化的，以该切入点进行药物干预试验应存在“时间窗”的问题，而如何确定这一时间窗也是需要研究的重点。

M1表型小胶质细胞是一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS) 的主要来源，其可以激活神经元中产生的NO，NO通过与超氧物的反应形成过氧亚硝酸根，进一步导致血脑屏障损坏[15]。另有实验表明，在脑出血的动物模型中应用iNOS抑制剂可以减少神经细胞的死亡和神经功能障碍，并且在胶原酶诱导的小鼠脑出血模型中，敲除其iNOS基因可以明显改善脑出血后的脑水肿[16]。脑出血后iNOS的激活已被许多研究所证实，通过对它的抑制可明显改善脑出血后的神经损伤情况，这也是当前脑出血新的治疗靶点。

在脑出血后激活的M1表型小胶质细胞大量表达基质金属蛋白酶(MMPs)，它是一类钙依赖的内肽酶，可以降解细胞外机制的任何成分，一般时候脑内含量极少，但是会对各种神经疾病作出反应[17]。目前研究主要集中在脑出血后2～3 d内增加的MMP-2和MMP-9，在脑出血后，TNF-α、IL-1β等促炎因子的高表达，通过激活NF-κB通路使MMP-2和MMP-9表达的增加，从而降解血脑屏障毛细血管内皮细胞间的紧密连接和基底膜蛋白而导致血脑屏障破坏、诱导细胞凋亡、与神经炎症反应[18]。在脑出血大鼠模型试验中，予以脂氧合酶A4甲酯(LXA 4 ME)进行脑室内注射治疗，抑制NF-κB依赖性MMP-9的表达，可以明显减轻早期脑损伤，有效保护血脑屏障[19]。最近有研究表明，在脑卒中、神经感染性疾病及多发硬化症等神经疾病的恢复期中，MMPs是起到有益作用，它可以增加生长因子的水平进而促进血管的再生及神经保护作用[20]，但是这种有利作用是否同样也适用于脑出血，或者说MMPs在脑出血后是否也存在双重作用，这需要进一步的研究证实。

3.2 M2的作用 在脑出血研究中，对M2表型小胶质细胞的研究远少于M1表型，目前认为M2极化小胶质细胞是中枢神经系统损伤后修复的关键，M2表型小胶质细胞被广泛认为具有神经保护作用，相比较M1表型产生许多促炎因子，M2表型的作用相反，它可以促进抗炎症因子的释放如IL-4、IL-10、TGF-β，从而表现出抗炎的作用，抑制免疫反应，通过清除损伤部位的细胞碎片促进脑组织的恢复，减轻局部炎症，并参与损伤组织的重塑，M2表型小胶质细胞的作用不仅表现在其抗炎作用，其也有利作用于吞噬细胞碎片及清除血肿[21]。除了产生抗炎因子，M2表型小胶质细胞还同时产生很多生长因子，包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，FGF-2)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor-1，IGF-1)和血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)，它们对诱导神经再生、促进血管生成、少突胶质细胞的成熟、轴突再生具有重要的意义[22]。目前对于M2表型极化作用减轻脑出血后损伤的研究仍较少，但是目前研究普遍认为M2表型小胶质细胞具有保护作用这一特点是肯定的，它在脑出血后的动态变化仍不明确，但是促进小胶质细胞从M1表型向M2表型转化是目前研究的重点，成为以后脑出血治疗方面重要的研究方向。

4 小胶质细胞M1/M2表型间转化

脑出血后小胶质细胞的极化是一个很复杂的过程，在实验中，通过观察M1表型和M2表型细胞标志物的变化，M1表型和M2表型之间似乎存在互相转化的过程。在胶原酶诱导的小鼠脑出血模型中，可以观察到前期占主导地位M1表型小胶质细胞在第1天～第3天向M2表型转变，而在全成分血注射诱导小鼠脑出血模型中，这种转变发生在第1周[23]。脑出血后在早期急性期，M1表型小胶质细胞产生促炎加重颅脑损伤，随后被M2型小胶质细胞所取代，起到抑制炎症反应、清除毒性物质及修复损伤神经等作用。近年来多项研究表明，对于缓解脑实质继发性损伤的策略，不应只局限于抑制小胶质细胞的活化，应该更多的注意小胶质细胞的比例，即促进小胶质细胞M1表型向M2表型转化这一方面。因此，开发能够改变M1/M2比值来调节免疫系统是治疗脑出血的一种很有前途的药物干预措施。

4.1 米诺环素 在脑出血动物实验中，米诺环素作为四环素类抗生素中的一种，可以有效地穿透血脑屏障，它可以通过TrkB/BDNF途径极化M2表型小胶质细胞，分泌抗炎细胞因子及神经营养因子，促进中枢神经系统损伤后的神经恢复[24]。目前有研究认为，在大鼠脑卒中模型中，米诺环素可以改善大鼠神经功能恢复，有很好抑制M1表型小胶质细胞从而达到抗炎的作用[25]。关于米诺环素，有临床试验已经评估了该药物治疗几种精神和神经疾病的潜力，包括主要的抑郁症、精神分裂症、双相情感障碍、卒中和肌萎缩侧索硬化症，但是对脑出血的治疗中还需要进一步的研究和系统评价[26]。

4.2 他汀类 他汀类药物以降低血清胆固醇水平和降低心血管事件而闻名，但其抗炎作用近年来得到人们的认可。由于他汀类药物的特殊性，他汀类药物已被应用与缺血性脑卒中的治疗[27]。在体外实验中，辛伐他汀通过促进M1型巨噬细胞表型向M2型巨噬细胞表型的转换而发挥抗炎作用，阿托伐他汀在心肌梗死中也表现出类似的作用。并可能通过p38MAPK依赖性PPAR促进循环单核细胞向M2表型巨噬细胞分化[28]。最近，在一些临床研究中，与不使用他汀类药物的患者相比，使用他汀类药物的患者不能促进神经功能恢复，但可以明显改善脑出血后的死亡率，特别是使用亲水性他汀类药物治疗的患者中[29]。关于他汀类药物，其对缺血性脑卒中的临床疗效已被证实，但是其对脑出血是否也有很好的治疗效果，需要进一步研究。

4.3 PPAR-γ激动剂 核激素受体PPAR是巨噬细胞M2样表型的主调节因子，PPAR-γ激动剂激活小胶质细胞进入M2表型状态，通过抑制NF-κB通路起到广泛的抗炎和组织修复作用。有研究表明PPAP-γ激动剂可以使M2标记物CD206、IL-4、IGF-1、TGF-1、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、G-CSF和GM-CSF水平升高，M1标记物CD86、COX-2、iNOS、IL-1β、IL-6水平降低，证明其可以增强小胶质细胞的吞噬功能，可以促进M1至M2的极化[30]。作为PPAR-γ激动剂，罗格列酮不仅是一种抗糖尿病药物，而且是一种神经保护剂，在局灶性脑缺血和进行性帕金森病小鼠模型中，罗格列酮具有促进小胶质细胞M2极化的作用。大量证据表明，PPAR-γ激动剂吡格列酮可以调节炎症反应和氧化应激，在慢性轻度应激的小鼠模型中，用吡格列酮治疗小鼠后，可以看到小胶质细胞M1标记物的表达降低，而M2标记物的表达升高。目前关于PPAR-γ激动剂的研究，在全成分血注射诱导的动物脑出血模型中，PPAR-γ激动剂通过诱导CD36表达上调，促进小胶质细胞吞噬红细胞，表明它可以有效的促进血肿的清除，减少神经元的损伤，在离体实验中也可减少炎症因子和自由基的产生，现在已开展了一项评价吡格列酮治疗脑出血血肿清除安全性的临床试验(SHRINC)[31]。

5 展 望

小胶质细胞的极化在脑出血的病理和相关进展中具有重要意义，随着小胶质细胞激活的机制日益阐明，其与神经系统疾病的关系逐渐明确。但是对小胶质细胞的极化动力学这方面的研究尚不完善，M1/M2样极化作用，一方面可以促进神经功能的恢复;另一方面可以促进炎症反应加重组织的损伤。小胶质细胞的M1和M2不同表型之间动态变化，对于脑组织损伤修复的调节起着重要的作用，现在对于小胶质细胞的广泛抑制已不再是治疗方案的研究重点，更加注重研究小胶质细胞表型转换的关键调控机制，在抑制早期M1表型极化的小胶质细胞和促进后期M2表型极化小胶质细胞的动态变化中找到一个最佳的平衡状态。从而最大限度的利用血肿清除和脑修复的自然过程。然而在目前的研究中存在一定的局限性，首先大多数的研究成果都是来源于啮齿动物脑出血模型，对于这些结果能否成功转化为临床应用，需要对脑出血患者组织病理学进行更深入研究并建立与临床疾病更加相似的脑出血动物模型。其次，目前的动物模型没有考虑到性别的差异以及激素对炎症可能造成的影响，因此今后的实验可以针对动物性别进行分组研究，为更好的将临床前发现转化为有效的临床治疗靶点。最后，目前药物干预小胶质细胞不同表型之间转化，大都着眼于表象，对于小胶质细胞表型转换的关键调控机制研究较少。今后的研究应主要集中于小胶质细胞M1/M2极化的具体调控机制，为治疗脑出血的药物干预提供新的切入点，为脑出血疾病的治疗提供新的方向。