精子线粒体膜电位评估男性生育力的作用研究进展*

钱路杰 综述 徐惠明 审校

1.浙江省妇幼和生殖保健中心（杭州 310012）；2.杭州师范大学（杭州 311121）

全球目前约有15%的适龄夫妇无法生育，其病因中男方因素占约20%，男方因素是导致适龄夫妇无法生育的重要原因之一[1,2]。另外目前国内外最新流行病学显示男性精液质量呈逐年下降趋势[3]。而不明原因的少、弱、畸形精子症，即特发性少、弱、畸形精子症，又占据男性不育中的较大比例，因此精液质量与男性生育力密切相关[4,5]。目前配偶妊娠与否是评价男性生育能力的金标准，而量化评价指标主要为妊娠等待时间（time to pregnancy，TTP）及精液质量。另外当前评价精液质量的主要指标依旧为精液常规参数中的精液量、精子活力、精子形态和精子浓度等。然而我们知道精子的发生、发展及在受精的过程中受到多方面因素的影响，任何环节的异常均可能导致不育，因此仅凭以上指标并不能准确地反映精子的内部结构和功能，无法全方面评估精子状态，故而无法全面评估男性生育能力[6,7]。近些年由于科技的发展，仪器设备的升级，分子生物学的日益更新，从微观分子水平上研究男性不育的发病机理的学者越来越多。精子线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)、精子内活性氧含量（reactive oxygen species，ROS）、精子囊性纤维化跨膜转导调节因子 (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)、精子DNA碎片等与精子受精能力的关系日益受到关注[7,8]。

一、精子线粒体结构与功能

线粒体是在光学显微镜下可见的、存在于大多数细胞中的、有两层膜包被的细胞器，直径约为0.5-1.0μm，是细胞中制造能量的主要场所。主要功能包括参与能量转化、三羧酸循环、氧化磷酸化及储存钙离子等，是新陈代谢和生物能量转换的关键所在。另外线粒体是目前已知除细胞核外唯一一个拥有自身的遗传物质的细胞器。Hikim A P等在研究中观察到线粒体膜电位降低会引起线粒体膜通透性改变，从而导致细胞色素C释放，在细胞质中与凋亡蛋白酶激活因子1相结合，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9（cysteine aspartic acid specificprotease-9，caspase-9），后再激活caspase-3、6和7蛋白水解酶，水解核纤层蛋白、肌动蛋白、肌纤蛋白等，最终引起细胞形态及细胞核呈现典型性的凋亡改变[9]。该研究证实了线粒体在细胞凋亡的过程中扮演着重要的角色。精子线粒体作为精子活动能量来源场所，且作为唯一带有独立DNA的细胞器，与精子发生发展、凋亡、受精过程密切相关。

国内外已开展精子线粒体功能与男性不育的相关性研究。目前研究证实精子受精过程所需的能量主要来自精子线粒体合成的ATP，且精子线粒体DNA与精子的发生、发展密切相关。精子线粒体的功能对精子质量及男性生育力存在至关重要的影响。而精子MMP是评价线粒体功能的重要指标之一。

目前精子MMP检测常用方法：禁欲3-7天后手淫法留取精液标本，洗涤两次（PBS，0.01mol/L，pH 7.4），离心（300×g，5分钟），弃上清液后PBS重悬沉淀精子，按试剂盒说明书要求调整精子浓度为1×106/ml。取50ul重悬后的精液标本加入500ul浓度为5ug/ml的JC-1单标试剂，充分混匀后在37℃的CO2培养箱中避光孵育10分钟，PBS洗涤去除多余染料后，再次重悬沉淀精子，调整精子浓度为1×106/ml，后用流式细胞仪检测。激发波长为488nm，通过荧光通道FL1（绿）和FL2（红）检测荧光强度(百分率表示)，每个样本检测10000个精子。绿色荧光说明MMP丧失或下降，线粒体功能受损，红色荧光说明MMP正常，线粒体功能良好。

二、精子MMP与精子质量及男性生育力关系的研究进展

精子MMP是指在正常精子线粒体中发生的三羧酸循环产生的能量传递给电子，电子经呼吸链的传递产生ATP，与此同时将质子从线粒体内膜的基质侧泵至内膜外,形成的跨膜电位差。精子MMP是评价精子线粒体功能的重要参数之一。

（一）精子MMP与精子活力、活率及生育力

Hoffman-Berling等[10]于1955年首次证明了精子尾部运动的主要能量来源是ATP。精子线粒体作为精子活动能量来源即产生ATP的主要场所，为精子尾部运动提供能量，与精子活力密切相关。Piasecka等[11]研究指出，精子线粒体膜电位下降与精子活力低下密切相关。而后Kasai T等[12]和Meseguer M等[13]进一步研究发现精子MMP与精子活率、活力及精子受精率呈正相关。

我国董浙清等[14]对104例男性不育症患者的精子MMP进行检测并进行相关性分析，其结论与Kasai T等[12]、Meseguer M等[13]及Piasecka等[11]相符合，研究指出精子MMP和精子活率、前向运动率、侧向运动率呈正相关。另外周秀芬等[15]对50例不育男性患者研究发现，弱精子症不育组MMP低于正常精子不育组。同样杨颖等[16]研究发现，与对照组相比,弱精子组MMP显著降低，另外与董浙清等研究结果相一致的是MMP与精子总活力、前向运动力呈显著正相关。白双勇等[17]研究发现正常不育组精子MMP率低于正常已生育组，与精子活动率呈正相关，与精子前向运动率呈正相关。吴佳学等[18]检测精子MMP也发现，不育组精子MMP低于正常组，精子MMP与精子前向运动率呈显著正相关。

精子MMP作为评价精子线粒体功能的主要指标之一，能较好的反应精子线粒体即产生ATP的功能。精子MMP的下降引起精子活力、活率下降，可能导致弱精子症的发生，影响受精过程。

（二）精子MMP与精子凋亡率及精子形态

Rawe等[19]研究指出，精子尾部纤维鞘结构异常与精子线粒体鞘数量呈负相关，与线粒体结构异常呈正相关，精子线粒体影响精子尾部正常形态率。另外Piasecka等[11]研究发现，精子活力低下与精子MMP降低密切相关，且活力低下的精子在形态上常伴随精子中段缺乏或精子线粒体结构异常。董浙清等[14]研究证实精子MMP与体部、尾部畸形率均具有很强的相关性，与体部畸形率、尾部畸形率呈负相关，而精子头部异常主要是由于核染色质异常或核膜异常而引起。另外研究结果还显示精子MMP与精子凋亡率呈负相关，与精子浓度呈正相关。周秀芬等[15]同样证实精子MMP丧失率与精子早期凋亡率正相关。杨颖等[16]研究发现，与董浙清及周秀芬等研究结果相一致的是MMP与正常精子形态率呈显著正相关,然而与年龄、精液量、精子浓度和精子数量其余参数的相关性均无统计学意义。白双勇等[17]研究发现精子MMP与精子浓度呈正相关，与精子总数呈正相关。吴佳学等[18]也发现，精子MMP与正常精子形态率呈显著正相关。

精子线粒体除了作为精子活动能量来源的主要场所外，是精子细胞中除细胞核外唯一带有独立DNA的细胞器，影响着精子细胞的发生发展及凋亡。精子MMP的下降引起精子凋亡率、体部畸形率、尾部畸形率的显著上升，影响精子形态、功能，导致男性生育力降低。

三、精子MMP、精子质量及男性生育力与精子ROS含量的关系探究

ROS是一大类具有化学反应性和连锁反应倾向的含氧物质、生物体有氧代谢的中间产物以及电子转移反应过程中产生的副产物[20]。精子内ROS是由精子线粒体呼吸链的一系列氧化反应或精子膜上的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶与其底物反应这两种途径生成。

（一）精液质量及男性生育力与精子ROS含量

目前的研究已证实，ROS会破坏生殖细胞的DNA结构，包括线粒体DNA[21]。被ROS损伤的DNA可诱导生殖细胞通过线粒体途径发生凋亡从而破坏正常精子数量、降低精子浓度，同时也会引起部分精子活动力的下降[22-24]。另一方面，ROS也可以直接损伤线粒体膜，诱导细胞凋亡。ROS亦可干预生精细胞的蛋白结构和功能，如可降低睾丸中抗氧化酶活性，加剧生殖细胞氧化应激；可降低能量生成相关酶活性，影响精子活动力等[25]。此外，ROS对精子结构蛋白如鞭毛、轴丝等的损害也可降低精子活动力，增加精子畸形率，最终降低男性生育力[26]。秦欣然等[27]总结指出精子低水平ROS对于男性生殖系统维持正常生理功能具有重要意义，而ROS过多则会导致氧化应激，损害雄性生殖器官、导致性激素分泌紊乱、破坏生殖细胞结构和功能甚至改变子代的表观遗传，最终影响男性的生育力。

精子ROS含量过多会导致氧化应激，破坏鞭毛、轴丝等结构蛋白功能，损伤线粒体膜，诱导生殖细胞线粒体途径的凋亡，降低精子浓度、活力，增加精子畸形率，最终影响男性生育力。

（二）精子MMP与精子ROS含量

有研究指出，ROS能破坏线粒体呼吸功能，降低精子MMP，阻碍能量生成，使得精子活动力进一步下降[28,29]。精子ROS含量过多可损伤其线粒体DNA，通过线粒体途径引起生殖细胞凋亡，亦可破坏线粒体膜结构、破坏线粒体呼吸功能，降低精子MMP。精子MMP的下降与精子ROS含量过多存在密切关联[30-32]。Wang X等[33]研究指出精子内ROS含量过高是导致精子MMP下降、精子细胞凋亡率升高的主要原因。

综上所述，精子MMP与精子浓度、精子总数、精子活力、精子活率，精子体尾部畸形率、早期凋亡率、精子受精率密切相关，精子内ROS含量过高可能是引起精子MMP下降的重要原因之一。

四、展望

目前男性不育的诊断主要依赖于常规的精液分析，包括精子浓度、活动力、形态等指标。但是仅仅依靠这些指标是远远不够的。男性不育的根本问题在于精子质量。精子MMP的测定是对精液质量及男性生育力评估的潜在指标。随着科学技术的日益更新，对于精子的发生发展过程以及其分子机制有了进一步的了解。目前在宏观上对于男性不育的诊断尚不全面，分子水平上微观的研究可以在本质上对男性不育的诊断提供重要的意义。本文就精子MMP的测定与精子质量、精子ROS含量及男性生育力的关系做一总结与探讨。然而国内外关于精子MMP的相关研究甚少，进一步探究精子MMP与精子内ROS含量、精子受精率的关系，测定我国精子MMP的正常参考范围值以及抗氧化药物等的应用对精子MMP的影响，对于我国男性不育的诊断及治疗，对于判别我国男性是否能让其配偶受孕的机会大小及其接受辅助生育技术成功率的可能性具有指导意义。