心血管系统中的生物钟和细胞周期

穆乐 李光华

750004 银川，宁夏医科大学基础医学院生理学系

自2017年诺贝尔生理学或医学奖颁给了在生物昼夜节律分子机制方面做出杰出贡献的3位科学家后，激发了很多生物医学领域的科学家们探索生物钟(circadian clocks)的兴趣。生物钟存在于机体的器官、组织乃至细胞中，可以直接调控心血管机能，包括血压高低、心率快慢、血管内皮功能等。细胞周期作为体内的振荡器，对于心肌细胞和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)的存活也至关重要。生物钟与细胞周期之间相互联系，前者在不同水平上参与细胞的增殖和凋亡，而细胞周期进程中关键周期蛋白的节律性表达与部分钟基因密切联系。因此，揭示生物钟基因与细胞周期之间的相互关联，将为心血管疾病预防与治疗提供新的思路。

1 生物钟在机体功能调控中的作用

1.1 生物钟系统

生物钟是通过参与生理、生化、行为过程而设定并调控机体昼夜周期的内在自主时钟控制系统，是维持机体节律性活动的基本单位。但产生和维持生物节律的根本原因是存在于生物各级水平的钟基因及其编码的蛋白质，它们彼此相互作用，构成一个或多个转录-翻译反馈回路，以维持近似24 h的周期节律振荡，实现有序、协同、高效的生命活动，从而适应外界环境的变化。从细胞层面来看，转录-翻译环路分子机制的过程如下[1]：Clock与Bmal1的基因表达产物是具有bHLH-PAS结构域的转录因子，二者可形成异源二聚体CLOCK/BMAL1，与靶基因启动子中的E-box的CACGTG序列结合，从而诱导Per和Cry基因的转录，并在细胞质中翻译成对应的PER和CRY蛋白，当胞浆里的PER和CRY蛋白积累达到高峰后，会形成稳定的PER和CRY蛋白复合物重新进入细胞核，抑制CLOCK和BMAL1的异源二聚化，形成主要的负反馈回路；同时CLOCK/BMAL1可以促进Rev-Erbα的转录和翻译，而Rev-Erbα可以抑制Bmal1的活化和mPer与mCry的转录，当CRY进入核内又可抑制mPer、mCry与Rev-Erbα的转录，由此解除抑制的Bmal1的转录。另一方面，BMAL1/CLOCK通过微小RNA的作用结合于Bmal1的3’非翻译区，形成Bmal1自身的负反馈表达调控。由于钟基因的反馈调节，生物体的生理活动得以优化并表现出明显的生物节律性。研究发现，在帕金森动物模型中Bmal1、Per1、Per2和Cry1表达的相应蛋白减少[2]；Bray等[3]发现，Clock基因突变的小鼠的心肌收缩力、新陈代谢功能都发生了不同程度的改变。大量研究证实，生物钟系统的异常引起一些钟基因表达的改变，可以参与心血管疾病、神经系统疾病等的病理过程，与疾病的发生发展以及预防治疗紧密关联。

1.2 钟基因对心血管活动的调节

哺乳动物的心脏和血管中都存在内源性的生物钟系统。 小鼠心肌组织中约13%的基因呈昼夜节律性表达。大鼠的内皮依赖性血管舒张功能也显示出清晰的昼夜节律。正常情况下，生物钟调控着机体心血管功能如血压高低、心率快慢、内皮依赖的血管舒缩功能等，且大部分心血管功能表现出夜间低、白昼高、下午达到峰值的变化特征。越来越多研究表明，生物钟在维持正常心血管功能中发挥重要作用，同时生物钟紊乱及钟基因异常能够影响动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的发生发展。

在心血管系统中，Bmal1、Per2和Cry发挥着重要的保护作用。Bmal1一旦缺失会直接影响血压和心率等基本生理指标。小鼠全身敲除Bmal1，其血压的正常昼夜节律会完全消除，同时引发低血压，其机制可能与儿茶酚胺的产生减少有关[4]。krlec等[5]利用单核苷酸多态性分析发现，Per2和Cry2基因的遗传变异可能与动脉粥样硬化有关。有实验采用无线电遥测技术发现，Bmal1-/-小鼠活动节律完全丧失，表现为持续性低血压，推测可能是一氧化氮信号解偶联、超氧化物增加，使血管内皮功能障碍，最终导致了血压水平异常[6]。Qiao等[7]发现，Bmal1可通过雷帕霉素靶蛋白信号通路调控自噬，从而保护心肌细胞免受高糖毒性。Bhatwadekar等[8]研究显示，血管内皮细胞缺失Bmal1会加速视网膜微血管和股动脉大血管的损伤。此外，Per2基因在维持血管内皮功能中作用更为明显。Per2基因敲除会造成小鼠夜间血压和心率的下降[9]。从健康动脉中提取血清检测血管内皮细胞的钟基因Per2、Bmal1和Cry1表达具有明显的昼夜节律性[10]。Per2突变小鼠模型中，小鼠主动脉环的内皮依赖性舒张活性降低，涉及一氧化氮和血管舒张性前列腺素的生成减少，以及环氧合酶1衍生的血管收缩因子释放增加，导致血管内皮功能障碍[11]。动脉粥样硬化患者与健康人群相比Cry1水平明显下调。研究发现，动脉粥样硬化模型小鼠过表达Cry1基因，小鼠粥样斑块面积减小，血中总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇水平降低。

随着对钟基因研究的深入关注，钟基因在心血管疾病中发挥的作用逐渐为我们所认识。将生物节律引入心血管疾病的临床治疗中已经显现出潜在的益处。Winter等[12]最新的研究显示，动脉粥样硬化病变部位髓系细胞的募集具有明显节律，因此提出了在高峰期给药抑制髓系细胞募集从而缓解动脉粥样硬化的策略。阿司匹林的降压疗效具有明显的时效性，无论是高血压患者还是在高盐引起的高血压小鼠模型，临睡前给予阿司匹林的降压效果明显优于清晨给药[13]。王艳君等[14]发现，辰时针刺可能通过提高SHR心脏Clock与Bmal1基因的表达水平、提高血清褪黑素含量及降低5-羟色胺含量，从而实现降压效果。Montaigne等[15]随机对患者的心肌标本进行转录分析，发现Rev-erbα核受体可能是心脏保护的潜在药理靶点。因此，生物钟对于心血管疾病的影响不可忽视。我们既要关注核心钟基因对于心血管功能的保护作用，更应该利用生物节律来治疗和预防心脑血管疾病，从而有助于优化心血管疾病的预防和治疗策略。

2 生物钟与细胞周期的相互作用

真核生物生命中最基本的两个周期是调节生命活动的生物钟和驱动细胞生长的细胞周期。一般情况下，细胞增殖通常表现为24 h的分裂速率，原因在于生物钟可以直接调控细胞周期。最新研究发现，敲除钟基因Bmal1或Clock会抑制Cyclin B1的表达，阻滞G2-M期的转变，表明生物钟与细胞周期之间存在相互作用[16]。越来越多的研究揭示了生物钟与细胞周期的相互作用常作用于细胞周期检查点：哺乳动物体内Per1和Per2基因抑制G1-S期转变，而Bmal1和Clock则参与调节G2-M期的转变。

随着时间治疗学的提出，在基础科研和临床疾病治疗中我们也关注到了生物钟和细胞周期之间的联系。Lee等[17]发现在肿瘤细胞或组织中，中断昼夜节律能够促进视网膜母细胞瘤蛋白的磷酸化，从而有利于细胞周期G1/S期的进行；在肺腺癌和肺鳞状细胞癌患者中发现，钟基因Per2、Clock和Cry2会激活RTK信号通路[18]。付小娟等[19]发现，人口腔鳞状细胞癌SCC15细胞沉默Per1基因后，Cyclin D1和Cyclin E表达显著增高，激活了CDK2、CDK4或CDK6的活性，同时p16和p21表达显著降低，对CDK2、CDK4和CDK6活性的抑制能力减弱，从而增强了细胞G1期的启动能力，促进细胞由G1期向S期加速过渡，促进细胞增殖。Cao等[20]发现，过表达Per1基因会抑制前列腺癌细胞增殖和促进细胞凋亡。沉默Per2基因可以下调部分生物钟相关因子和周期调控基因的mRNA表达，并主要通过抑制Cyclin D1与CDK4的表达而阻滞细胞从G1期向S期转换。另外，降低Cyclin B1的表达可以抑制Bmal1的表达，Bmal1基因过表达后Cyclin B1表达减少及p21表达增加。血管内皮细胞一氧化氮是在一氧化氮合酶(NOS)催化下合成的内源性硝基血管扩张剂，主要修复血管内皮损伤，eNOS能够抑制血管内皮细胞的增殖，诱导凋亡等。研究发现，转染eNOS后的细胞，eNOS mRNA表达下降，并通过cGMP途径上调细胞周期依赖性蛋白酶抑制剂P27和p21的表达，抑制Rb蛋白磷酸化，使血管内皮细胞的生长停滞在G0期，从而抑制血管内皮细胞的增殖[21]。生物钟与细胞周期的相互作用显而易见。

3 细胞周期在心血管系统中的调控作用

3.1 细胞周期调控网络

细胞周期是细胞生命活动的基本过程。正常细胞周期经历了G1-S-G2-M四个时相，其中包括G1/S期、G2/M期和中期3个主要检查点。细胞周期的顺利推进离不开细胞周期蛋白(Cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinases，CDKs)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitors，CKIs)组成的Cyclins-CDKs-CKIs分子网络调控。

G1期是启动细胞周期进行的关键，有丝分裂信号诱导Cyclin D1的表达，Cyclin D1与CDK4或CDK6结合并激活，驱动细胞合成细胞生长所需的各种蛋白质、糖类、脂类等，以确保DNA的复制。Cyclin D蛋白会在S期降解以确保DNA复制的高保真性。Cyclin E2与CDk2是调控细胞周期G1/S期过渡的关键物质，Cyclin E2可以进一步磷酸化Rb蛋白，释放转录因子和核苷酸合成所需基因，从而促进S期进展。Cyclin A2能与CDK2结合并激活CDK2，Cyclin A2-CDK2复合物通过Bora的直接磷酸化刺激PLK1，去除抑制性磷酸化所需的磷酸酶，从而诱导细胞进入G2期。Cyclin B1与CDK1结合激活CDK1，CDK1/Cyclin B1复合体驱动细胞从G2期向M期转化。同时Cyclin B1在G2晚期达到峰值，完全磷酸化细胞分裂所需的各种底物[22]。

细胞的快速生长和分裂是心血管系统疾病发生发展的共同特征。心肌细胞的增殖调控是一个极其复杂的生理过程，中晚期实验胎鼠若缺乏Cyclin D蛋白，会死于继发性心脏畸形。体外高表达Cyclin B1/CDK2能够促进心肌细胞顺利进入细胞周期[23]。因此，特异性抑制Cyclin D或Cyclin B等细胞周期蛋白的表达可以抑制心肌细胞增殖，关注细胞周期中的关键蛋白将是开发心血管疾病治疗的新靶点。

3.2 血管内皮细胞增殖的信号通路

血管内皮是由单层的内皮细胞紧密相连形成的，其完整性是维持血管稳态的基础，而细胞周期是保证血管内皮完整性的关键。心血管疾病的发生发展是复杂的，研究表明细胞接受不同因素刺激后，会激活相关信号通路引起Cyclins/CDKs的改变，进而调控细胞增殖。PI3K/Akt是介导血管内皮细胞增殖的重要信号通路，Akt主要介导细胞增殖与凋亡，在动脉粥样硬化和血管重构中，Akt可以促进VSMC的增殖从而保护血管内皮细胞[24]。Wnt信号通路可以促进VSMC的增殖和迁移，提示我们可以开发Wnt通路抑制剂来干预动脉粥样硬化的发生。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulating kinase，ERK)在细胞增殖的过程中可以刺激细胞周期蛋白的表达，促进细胞周期的进展。使用PI3K或Akt抑制剂可以抑制VSMC的增殖[25]。研究发现，AngⅡ诱导VSMCs细胞内高表达钟基因Per1、Per2，从而激活RAS/ERK通路，影响Cyclin E的表达，最终影响VSMCs的增殖[26]。研究表明，ERK通路通过改变Cyclin D1进而影响细胞周期的进程[27]。信号通路参与调控血管内皮细胞的生长、增殖迁移及影响细胞周期关键蛋白的表达，以此通路作为基点开发心血管疾病的治疗靶点具有重要意义。

3.3 细胞周期变化与心血管活动的调节

心血管疾病仍然是导致全世界人类死亡的主要原因。我们常见的心血管疾病大多表现为血管细胞和心肌细胞的过度增殖，包括动脉粥样硬化、高血压和心肌病等。

哺乳动物胚胎期的心肌细胞可以在细胞周期的G1、S、G2和M期高表达相应的Cyclins，从而促进心肌细胞的快速增殖。心脏再生与心肌细胞的增殖直接相关。出生后的心脏体外高表达相关的Cyclins，如Cyclin D1和Cyclin A1等增加了细胞周期活性，能够造成心肌肥大，若上调CDK抑制剂p21等可以抑制心肌细胞的增殖[28]。表达Cyclin D2转基因的小鼠介导的小鼠心脏再生[29]。Lin等[30]发现，氧化型低密度脂蛋白可能通过正向调控CDK2、CDK4、Cyclin E和Cyclin D等表达及负向调节p21和p27的表达，促进人类主动脉VSMC增殖，促进了动脉粥样硬化的形成。Tanner 等[31]研究发现，对照血压正常大鼠，自发性高血压大鼠的主动脉VSMC在G1期高表达Cyclin D、Cyclin E和Cyclin A，但CDK2和p21、p27的表达水平无明显差异，表明自发性高血压的VSMC更易增殖。转基因成年小鼠的心肌过表达Cyclin D1、Cyclin D2或Cyclin D3会明显增加心肌DNA合成[32]。患有心肌病的个体的CDK9活性增加，CDK9可以使RNA酶Ⅱ的COOH末端区域(CTD)磷酸化后，直接与核因子相互作用解离出snRNA，因此促进了心肌细胞的肥大和增殖[33]。综上，当心肌或血管受损后，细胞周期调控蛋白中Cyclins和CDKs的表达上调而CDKIs(如p21、p27)的表达下调，提示开发有效的细胞周期抑制剂可以阻滞细胞的过度生长，这为预防和治疗动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病提供了可能。

4 结语与展望

生物钟在维护机体的生命健康方面发挥重要作用。钟基因Per2和Bmal1对心脏具有保护作用，相反，如果出现钟基因的缺失或突变会造成动脉粥样硬化、血管内皮功能障碍、高血压等。细胞周期是维持细胞功能完整性的关键，细胞过度增殖是心血管疾病的明显特征，而核心钟基因可以抑制细胞周期的进展。综上，生物钟和细胞周期同是生物体内的振荡器，钟基因的正常表达与细胞周期的正常推进可以维持和保护正常心血管功能，因此关注钟基因及开发细胞周期抑制剂将会成为心血管疾病的治疗新靶点。

利益冲突：无