外泌体在肺癌诊断及预后中的价值探讨

唐黎威 竺王玉 乐涵波

肺癌患者生存率低的主要因素包括缺乏早期有效诊断及预后不良，因为早期肺癌的临床症状并没有特异性，许多患者在发现时已经处于晚期，导致后续的治疗也不甚理想。因此在病变早期及时得到诊断、治疗，并对预后进行监测，才能获得较好的疗效，这对提高肺癌患者的生存率尤为重要。目前，低剂量螺旋CT 是一种较为有效的早期筛查方式，组织活检则可以作为确诊的一项标准，但是这两种方法仍存在一定的局限性，因此迫切需要开发新的检测手段。液体活检作为近年来出现的一项突破性技术，是一种非侵入式的血液检测，主要包括循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA 以及外泌体的检测[1-2]。目前，针对外泌体的研究越来越多，外泌体已经逐渐成为在早期肺癌诊断和监测预后等方面的研究热点，因此探索肺癌外泌体将为肺癌的诊断和预后开拓新的视野。本文就外泌体中的蛋白质、脂质及miRNA 作为肺癌诊断和预后标志物的研究进展作一综述。

1 外泌体概述

1983 年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987 年Johnstone 将其命名为“exosome”。外泌体是直径约为30～100 nm 的双膜杯状囊泡，主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到细胞外基质中。目前发现多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，如网织红细胞、B 淋巴细胞、T 细胞、血小板、肥大细胞、树突状细胞和巨噬细胞，也可由非造血来源的细胞产生，如上皮细胞（肠上皮细胞）、施万氏细胞、星形胶质细胞、神经元、间皮瘤细胞、脂肪细胞、成纤维细胞和肿瘤细胞等，并可释放到生物体液中，如唾液、血浆、尿液、母乳、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液和腹水等[1，3-5]，因此，外泌体获取来源可有多种选择。既往研究表明，外泌体可以作为信号物质在靶细胞中传递，并且携带有多种蛋白质、核酸和脂质等，这些生物活性分子被一层脂质双层膜所包围，因此这些生物源在循环中就可免受降解，成为稳定的传递信号分子，形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递系统，可参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。进一步研究表明，外泌体的分泌运输主要通过两种方式，其中一种形成、运输机制需要内涵体分选转运复合体（ESCRT），ESCRT 由4 种蛋白质组成，它在外泌体内腔中包装生物分子以及帮助外泌体从细胞中释放出去等方面起着重要的作用；另一种分泌方式是ESCRT 非依赖性机制，这种外泌体分泌方式需要鞘脂（神经酰胺）帮助[3，5-6]。现有的研究已经证明肿瘤细胞分泌的大量外泌体所包含的特异性蛋白质、核酸等可以反映亲代细胞的特征，因此肿瘤来源的外泌体可以帮助探索外泌体在促进肿瘤细胞增殖、细胞外基质重塑、迁移侵袭、血管生成中发挥的作用，进一步了解外泌体对肿瘤细胞的免疫抑制作用，以及分析外泌体在肿瘤细胞产生耐药性中的作用机制[4-5，7-8]。肺癌来源的外泌体具有上述特点，因此鉴定肺癌来源的外泌体成分可以为肺癌的诊断和监测预后提供重要的临床参考。

2 外泌体对于肺癌的诊断作用

2.1 外泌体相关蛋白质与肺癌的诊断 外泌体是内吞起源的多囊泡体，并且可由正常或病理状态的细胞释放，它的成分可以反映亲代细胞的特征。研究发现，外泌体中所包含的蛋白质、miRNA 以及脂质等生物分子对于肺癌的诊断具有很大的价值[1-2]。其中，膜转运和融合蛋白、热休克蛋白（HSP）、鸟苷三磷酸酶、多囊泡体生物发生蛋白、细胞骨架蛋白、代谢酶、信号转导蛋白和载体是外泌体中最常见的鉴定蛋白。另外，诸如四跨膜蛋白家族（CD63、CD81、CD9）、肿瘤易感基因101、调亡相关基因-2 受体蛋白和HSP 普遍存在于外泌体中，这些蛋白质通常可以作为识别外泌体的标志物[3，5，9-10]。已有研究表明，CD151、CD171 和四跨膜蛋白8（TSPAN8）这3种外泌体蛋白可以用来鉴别诊断肺癌患者，且进一步研究发现它们可以区别肺癌的组织学类型，高水平的外泌体CD151 与肿瘤的侵袭性相关，且CD151 和TSPAN8与肺癌转移密切相关，外泌体CD171 则与肺癌上皮间充质转变、转移和预后不良有关[10-14]。另有研究表明，在唾液中检测到的外泌体蛋白具有肿瘤特异性，同时发现非小细胞肺癌（NSCLC）患者能够在尿液中检测到外泌体；对此，通过免疫组化染色检测到原发性肿瘤中富含亮氨酸α-2 糖蛋白1（Lrg1）的高表达与尿液标本中Lrg1 的存在呈一定程度上的正相关，这提示了尿液中外泌体的Lrg1 可能来源于原发性肿瘤组织，因此检测尿液中外泌体的Lrg1 也可以作为诊断NSCLC 患者的潜在标志物[3，9，13-17]。此外还有研究发现丝甘蛋白聚糖、原肌球蛋白3、血小板反应蛋白以及含有HECT 结构域的E3 泛素连接酶在作为区分肺腺癌的生物标志物时具有较强的特异性。综上研究表明，外泌体相关蛋白质在肺癌的诊断方面具有巨大潜力。

2.2 外泌体脂质与肺癌的诊断 在外泌体中检测到的脂质具有外泌体细胞起源的特征。外泌体富含有作为信号分子的脂质，包括TC、TG、鞘磷脂、磷脂、甘油磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、聚甘油磷脂、前列腺素和白三烯以及相关的脂类代谢活性酶等。且进一步研究发现，与亲代细胞相比，某些外泌体脂质（鞘磷脂、甘油磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇）的比例显著升高，而且发现神经酰胺对于外泌体的发生和触发癌细胞死亡起到非常重要的作用，这可能提示了脂质在外泌体的生物发生和在肿瘤微环境中的作用扮演了重要角色，影响了肿瘤的发展[5，9，19]。在一项研究中，研究人员使用了超高分辨率傅里叶变换质谱法探讨了NSCLC 患者血浆外泌体的脂质谱，采集了39例健康体检者和91 例NSCLC 患者（早期44 例，晚期47例）的血浆外泌体脂质谱，使用两种统计学方法LASSO和RF 进行分析，结果显示使用所选特征脂质的早期和晚期NSCLC 患者与健康体检者相比，AUC 分别为0.79和0.77（LASSO）、0.85 和0.88（RF），成功地将健康体检者、早期和晚期NSCLC 患者区分开来[19]。

2.3 外泌体相关miRNA 与肺癌的诊断 外泌体RNA因其高度的肿瘤特异性而具有很高的临床诊断价值。miRNA 是短的（18～25 nt）、单链非编码RNA，目前已证明外泌体miRNA 的表达与多种癌症相关。研究表明肺癌患者的外泌体RNA 水平明显高于健康者，且RNA水平与肺癌的进展程度、治疗反应、生存率都密切相关。通过基因芯片、高通量测序法和qRT-PCR 等方法发现血液循环中的外泌体miRNA 对NSCLC 的诊断有较大帮助。已有大量研究证明有12 个特异性外泌体miRNA（miR-17-3p、miR-21、miR-106a、miR-146、miR-155、miR-191、miR-192、miR-203、miR-205、miR-210、miR-212和miR-214）是有助于筛选肺癌的生物标志物[4-5，8，15，20]。在一项实验中发现，与健康对照组相比，NSCLC 患者分离的外泌体中发现有8 种miRNA（miR-30b、miR-30c、miR-103、miR-122、miR-195、miR-203、miR-221 和miR-222）的表达存在差异[8]。最近有报道称外泌体miRNA 能够显著区分肺癌患者组与健康对照组，并且发现在肺鳞状细胞癌中，外泌体内的5 种miRNA（miR-205、miR-19a、miR-19b、miR-30b 和miR-20a）水平可被用作诊断标志物[6，8，14]。在另外一些研究中发现，血浆外泌体中鉴定出的4 种miRNA（miR-378a、miR-379、miR-139-5p 和miR-200b-5p）在筛选和区分肺病变（肺腺癌和肉芽肿）患者和健康对照者中有一定意义[4]。此外，还有研究选择了6 种外泌体miRNA（miR-151a-5p、miR-30a-3p、miR-200b-5p、miR-629、miR-100 和miR-154-3p）来作为诊断标志物以区分肺腺癌和肉芽肿，发现它们具有诊断意义[4，6，21，22]。一项前瞻性研究则探讨了支气管肺泡灌洗液外泌体miRNA 对于肺腺癌的早期诊断价值，评估了已知对肺腺癌有诊断价值的miRNAs（miR-7、miR-21、miR-126、let-7a、miR-17 和miR-19），其中发现miR-126 和let-7a 水平有明显升高，进一步证明了对于早期肺腺癌的诊断价值[23]。另有研究则探讨了有利于肺癌诊断而不是非肿瘤性病因（如结核病）的miRNA（miR-205-5p、miR-483-5p、miR-375、miR-200C-3p、miR-429、miR-200b-3p、miR-200a-3p、miR-203a-3p 和miR-141-3p），发现具有诊断意义[17，22]。综上所述，分析外泌体miRNA 可为探索早期肺癌诊断的分子标志物提供理论依据。

3 外泌体对肺癌的预后作用

3.1 外泌体蛋白质对肺癌的预后 目前，肺癌的治疗以手术、化学治疗、放射治疗、分子靶向治疗的综合治疗为主，但由于肺癌的晚期诊断和肺癌治疗中的获得性耐药，导致患者预后往往较差，因此监测肺癌患者预后尤为重要。研究发现，基于外泌体及其相关成分的研究对于监测预后有重大意义。外泌体中有几种与肺癌发展相关的蛋白，如表皮生长因子受体（EGFR）、鼠类肉瘤病毒癌基因（Kras）、细胞外基质金属蛋白酶诱导剂、紧密连接蛋白和Rab 家族蛋白等，这些蛋白的表达与肺癌患者的不良预后密切相关，因此检测外泌体中的此类蛋白表达可以帮助监测预后。其他研究也表明膜蛋白CD91、CD317 和EGFR 是NSCLC 潜在的外泌体标志物，并且发现在NSCLC 患者中纽约食管鳞癌蛋白1、EGFR 和人胎盘碱性磷酸酶水平增加，CD171 表达与患者不良预后相关，T 细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3 和半乳糖凝集素9这两种蛋白质则与肿瘤大小和分期相关，并有助于区分转移性和非转移性NSCLC 的脂多糖结合蛋白[6，14，17，24-26]。另外，在一项相关研究中对NSCLC 外泌体蛋白组学进行分析后发现，EGFR、信号转导相关蛋白等含量均明显增加，还发现在NSCLC 外泌体中肝细胞生长因子受体、Ras 相关的C3 肉毒素底物1 和Kras 蛋白水平均明显增加[6，9，14-15]。还有研究结果表明，HSP 90、细胞周期蛋白D1（CCND1）、血管内皮生长因子、Notch1 蛋白和基质金属蛋白酶2 在复发性肿瘤患者中的表达水平明显高于原发性肿瘤患者，其中CCND1 是NSCLC 中研究最多的细胞周期蛋白之一，但由于其在肺癌患者预后中的作用在一些文献报道中存在争议，仍需要更进一步研究进行证明[20]。还有一项研究则探讨了Rab 蛋白家族中的RabA 和RabB，发现其表达水平与肺癌转移预后相关，特别是RabB 的高表达是肺鳞癌不良预后的因素之一，而RabA 则需要更进一步的验证[27]。总之，上述外泌体蛋白质的探索对于肺癌预后研究进展具有非常重要的意义。

3.2 外泌体相关miRNA 对肺癌的预后 外泌体中的miRNA 是被用作监测肺癌预后的一种重要生物标志。相关miRNA（let-7、miR-221、miR-137、miR-372 和miR-182）的表达与肺癌患者的生存率有一定关系。研究证明，包括miR-486、miR-30d、miR-1、miR-499 在内的miRNA的表达水平与疾病预后显著相关，而在肺腺癌患者中，相关miRNA 在肿瘤组织中高度表达，表明了let-73、miR-25、miR-191、miR-34a、miR-34c 与患者预后相关。同样有研究发现，miR-129-3、miR-96、miR-21、miR-95、miR-155 和miR-337-5p 在肿瘤复发患者中表达上调，特别是miR-21 和miR-155 表达呈显著上调[20，24]。另一方面从NSCLC 复发患者分离出的外泌体中miR-21 和miR-4257 水平与无复发患者具有高度可比性，它们在疾病复发患者中的水平显著上调，且这两种外泌体miRNA 也与肿瘤的大小、组织类型和转移有关，表明这两种外泌体miRNA 是可以作为NSCLC 患者复发的生物标志物；相对的，与肿瘤抑制相关的两种miRNAs，即miR-51 和miR-373 的外泌体表达在肺癌患者中降低，与患者不良预后相关[6，14，16，28-30]。EGFR 突变是NSCLC患者预后不良的最常见的一种因素，基于此有研究发现外泌体miRNA（miR-25、miR-122、miR-195、miR-21和miR-125b）与EGFR 突变的NSCLC 患者对吉非替尼的敏感性有关，表明外泌体有可能对于患者的靶向治疗选择有一定帮助，而外泌体miR-221 和miR-222 与EGFR 突变患者对奥西替尼的良好治疗反应有关[8，17，26]。还有报道称miR-23b-3p、miR-10b-5p 和miR-21-5p水平在NSCLC 患者中被证实是上调的，同样证明其是有前景的预后生物标志物，有待于更深入的研究[6，14，22，26]。另外在几项临床试验中，研究者测定比较了肺癌患者和健康对照组间miRNA 表达的相对变化，发现在外泌体中相关miRNA（miR-30b、miR-30c、miR-103、miR-122、miR-195、miR-203、miR-221 和miR-222）呈高水平状态，表明这些miRNA 作为肺癌的标志物具有监测预后价值[9]。综上所述，分析外泌体中的相关蛋白以及miRNA对于肺癌患者的预后评估具有很大帮助。

4 小结

肺癌的早期诊断和预后监测是提高患者生存率的关键，得益于液体活检这一项技术的发展和成熟，外泌体作为液体活检的对象之一，在各方面都具有很大的潜力。液体活检与以往作为金标准的组织活检不同，组织活检是一种侵入性的检查，具有一定的局限性（如肿瘤的异质性和进化、肿瘤组织无法获取或不足以进行完整的基因分析以及对于患者的侵入性风险等），液体活检相对于传统的手术活检和穿刺活检相比，优势在于它是一项非侵入性的技术，对患者的不良反应更小，可以重复获取样本，且成本更为低廉。然而，目前对于外泌体的研究仍存在以下几个问题：（1）外泌体作为肿瘤微环境的重要组成部分，其在NSCLC 的进展过程中的具体作用机制尚不清楚，外泌体可以在肺癌细胞及其微环境之间转移具有生物活性的分子，但是其能准确将这些生物分子递送到特定靶细胞的机制仍需要阐明；（2）外泌体在NSCLC 诊治中的灵敏度和特异度有待提高；（3）由于目前技术的限制和较高的研究成本，获得大量的、高纯度的外泌体及外泌体全面表征仍具有挑战性，这也将影响临床应用、生物医学研究和生产成本，因此需要结合多种分离技术来优化外泌体的分离及富集；（4）外泌体的定量、纯化和保存尚未标准化，这对实验过程和结果产生一定影响；（5）外泌体是一种很有前景的肺癌诊断、监测预后以及实时监测治疗效果的生物标志物，但目前的研究样本量通常较少，重复性较差，因此需要大型的多中心研究提高液体活检的有效性；（6）外泌体用于靶向治疗的不良反应目前还尚未明确。基于上述问题，仍需要对外泌体作为肺癌诊断标志物进行大量验证和分析。随着对外泌体生物学结构和功能及其在肺癌发生、发展中机制的进一步研究和更深入的理解，相信外泌体作为液体活检的对象之一及蛋白质、DNA 及RNA 等稳定遗传物质的可靠来源，可以为肺癌的早期诊断和预后监测提供新的策略。