缺氧诱导因子-1α在喉癌中的研究进展

高伟 邬信芳 李钦

[1.山东第一医科大学(山东省医学科学院) 泰安 271000；2.滨州医学院 滨州 256600；3.山东临沂市人民医院耳鼻喉科 临沂 276002]

喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤。2018年国家癌症中心统计数据显示我国2014年喉癌发病2.34万例，死亡1.32万例[1]。虽然近年来喉癌治疗方式不断进步和改善，但喉癌患者的5年生存率并未得到明显提升，甚至有学者[2]认为其5年生存率呈下降趋势。因此，探究喉癌的发生、发展机制，寻找新的、更为有效的诊断和治疗策略，对于喉癌患者的治疗和预后有重大意义。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HⅠF-1α)由Semenza等[3]首次发现，是组织细胞低氧应激的重要标志物，与多种肿瘤的发生、发展关系密切[3-4]。近年来HⅠF-1α在喉癌中的重要性，引起学者们的普遍关注。本文复习国内外相关文献，就HⅠF-1α与喉癌发生、发展、治疗和预后的关系做一综述。

1 HIF-1α概述

1.1 HⅠF-1α分子结构 HⅠF-1α亚基是异二聚体蛋白HⅠF-1的活性亚基，其调节依赖于细胞内环境中氧浓度的大小[5]。α亚基的氨基端由bHLH和PAS结构域组成，其功能与形成二聚体和结合其下游靶基因相关。其羧基端含有调节转录的反式激活结构域-C(transactivation domain-C terminal，TAD-C)、激活转录的反式激活结构域-N(transactivation domain-N terminal，TAD-N)、富含Pro/Ser/Thr 的氧依赖降解结构域(oxygen-dependent degradation domain，ODDD)和具有负调控反式激活结构域作用的抑制结构域[6]。与α亚基结构相似的HⅠF-1组成型亚基β亚基，又称芳香烃受体核转运体(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT)，可与多种bHLH-PAS蛋白发生异二聚反应，在细胞内可稳定性表达[7]。因此，HⅠF-1α的含量决定HⅠF-1的表达水平和生物活性。

1.2 HⅠF-1α的调控 HⅠF-1α的表达调控可分为氧依赖调节途径和非氧依赖调节途径。氧依赖调节途径有2种氧依赖酶参与：低氧诱导因子-1抑制因子(factor-inhibiting HⅠF-1，FⅠH-1)和脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylases，PHD)。FⅠH-1是一种天冬酰胺β羟化酶，属于2-氧戊二酸和铁依赖性双加氧酶(2-oxoglutarate and iron-dependent dioxygenases)超家族中的一员，可催化天冬酰胺羟化反应。FⅠH-1在HⅠF-1α中特定天冬氨酸残基(Asn803)的羟化作用阻止HⅠF-1α转录因子与CBP/p300转录辅激活因子的结合，从而抑制HⅠF-1介导的基因转录[8]。不同的是，同属于2-氧戊二酸和铁依赖性双加氧酶超家族的PHD则通过羟基化修饰HⅠF-1α中特定脯氨酸残基，羟基化的HⅠF-1α被von Hippel-Lindau蛋白识别后被E3泛素连接酶复合物捕获后泛素化，继而在蛋白酶体上被降解[9]。PHD和FⅠH-1的羟基化作用均需要分子氧的参与，因此当细胞内分子氧浓度降低时，FⅠH-1和PHD 对HⅠF-1α的降解能力及抑制转录活性能力受到影响，累积的HⅠF-1α在细胞核内与β亚基形成有活性的HⅠF-1异二聚体蛋白。

在非氧依赖调节途径中，细胞因子、生长因子和病毒蛋白等刺激因子可在常氧条件下促使组织细胞内HⅠF-1α mRNA和蛋白的表达量增加。与低氧条件下HⅠF-1α降解受阻不同，在常氧条件下细胞内HⅠF-1α的降解并不受影响，HⅠF-1α表达的增加打破了合成和降解之间的平衡促进HⅠF-1α的累积[10]。一项研究[11]显示高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1, HMGB1)可通过PⅠ3K-Akt途径使乳腺癌中HⅠF-1α及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达上调，促进乳腺癌细胞血管生成和肿瘤转移。在另一项研究[12]中发现潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)不仅可通过增加鼻咽癌中HⅠF-1α mRNA的转录从而提高的HⅠF-1α蛋白表达水平，还可增强HⅠF-1α蛋白的稳定性。HⅠF-1α在常氧条件下的调控机制与肿瘤的发生、发展存在密切关联。

2 HIF-1α与喉癌的进展

HⅠF-1α通过调控近百种靶基因，如VEGF、葡萄糖转运蛋白-1(glucoes transporter-1，GLUT-1)、碳酸酐酶ⅠX(carbonic anhydrase-ⅠX，CA-ⅠX)等，涉及细胞生长发育及代谢的众多方面，如缺氧代偿性反应、免疫反应、新生血管的生成调节、细胞外基质纤维化、转录调控、物质运输、能量代谢等[13]。近年来多项研究显示HⅠF-1α及其靶基因与喉癌的进展关系密切。

2.1 HⅠF-1α与喉癌能量代谢 在快速生长的肿瘤组织中，其糖代谢与正常细胞不同，HⅠF-1α可通过一系列调控帮助肿瘤细胞将葡萄糖代谢从氧化磷酸化转变为糖酵解，产生大量ATP，以维持其快速增殖所需的能量消耗(Warburg效应)[14]。一项将100例喉癌术后辅助放射治疗(简称放疗)患者作为研究对象的回顾性分析[15]中发现HⅠF-1α和GLUT-1在喉鳞状细胞癌组织中阳性表达率较正常组织明显增高。HⅠF-1α的高表达与高淋巴结转移率、较低的分化程度以及高临床分期密切相关，GLUT-1则只与颈部淋巴结转移相关。徐鸥等[16]的研究得到相同的结果。另外，他们的体外实验显示人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞中HⅠF-1α、GLUT-1和VEGF的表达在低氧条件下明显升高，使Hep-2细胞在低氧条件下也能正常生长。李珂等[17]的一项体外实验研究显示随着缺氧时间的延长，喉癌Hep-2细胞内HⅠF-1α mRNA表达水平无明显变化，HⅠF-1α蛋白、GLUT-1 mRNA及GLUT-1蛋白的表达水平逐渐升高，侵袭能力及存活能力也逐渐增强。Lu等[18]利用癌症基因组编辑和功能分析的工具CRⅠSPR/CAS9系统将Hep2喉癌细胞中HⅠF-1α基因和GLUT-1基因诱导敲除，发现基因敲除后的Hep2喉癌细胞内HⅠF-1α和GLUT-1蛋白表达水平明显降低，磷脂酰肌醇3-激酶(PⅠ3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路受到抑制，其增殖率、迁移侵袭能力、葡萄摄取能力以及乳酸生成量也均低于基因敲除前。PⅠ3K/AKT信号通路不仅与细胞的增殖和凋亡相关，且与细胞的糖酵解过程有着密切联系[19]。这些研究表明，HⅠF-1α可能通过PⅠ3K/AKT信号通路调控靶基因GLUT-1的表达促进葡萄糖转运和增强Warburg效应影响喉癌细胞的能量代谢，增强其增殖、转移和侵袭能力。

2.2 HⅠF-1α与喉癌血管新生 新生血管增多是肿瘤的标志，也是肿瘤生长的基础。有学者[20]提出直径不超过2～3 mm早期实体肿瘤的生长不需要新生血管。在这个阶段，肿瘤很少发生转移，肿瘤组织主要通过扩散从相邻的组织血管中吸收营养和氧气。随着肿瘤组织的不断生长，肿瘤开始分泌VEGF促进新生血管形成，为肿瘤的生长和转移创造条件。VEGF是目前已知的最有效、最直接的血管生成蛋白，可增加血管通透性，刺激血管内皮细胞增殖和迁移。有研究[21]表明喉癌组织中HⅠF-1α和VEGF高表达的患者预后较差。李晓明等[22]研究发现在声门上型喉癌中HⅠF-1α与VEGF的表达呈正相关，颈部淋巴结转移者HⅠF-1α、VEGF、微血管密度(miorovessel densiry，MVD)和淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)明显高于无颈部淋巴结转移者。邱亚双等[23]的研究得到了相似的结果。他们发现在喉癌组织中HⅠF-1α和VEGF的表达明显高于癌旁正常组织，HⅠF-1α的高表达与高淋巴结转移率、较低的分化程度以及高临床分期密切相关，VEGF的高表达则与淋巴结转移和高临床分期相关。上述研究表明在喉癌组织中，HⅠF-1α与VEGF的高表达促进新生血管及淋巴管形成，推动喉癌的进展。

3 HIF-1α与喉癌的治疗

目前，以放射化学治疗(简称放化疗)为主的非手术保喉治疗模式得到学者们越来越多的关注。然而，此种治疗模式虽然能在解剖上保留喉部器官，但却对喉癌的总体生存率及喉功能的保留却没有明显的提升[24]。近年来，研究显示HⅠF-1α的高表达与喉癌的放化疗抵抗密切相关。抑制HⅠF-1α及其靶基因的表达，增强喉癌对放化疗的敏感度，或将成为提高喉癌患者生存率和保留喉功能的新选择。

3.1 HⅠF-1α与喉癌的放疗 肿瘤放疗抵抗是多因素参与的复杂过程，是放疗临床效果不佳的原因之一。有研究[25]显示HⅠF-1α在放疗后24 h即可呈高表达状态，并在肿瘤放疗抵抗中起关键性作用。Kwon等[26]对42例单纯放疗的早期喉鳞状细胞癌(T1和T2)组织标本中HⅠF-1α、CA-ⅠX、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、Ki67和促红细胞生成素(erythropoietin， EPO)受体的表达情况进行检测，发现只有HⅠF-1α或CA-ⅠX的高表达与放疗后喉癌组织残留密切相关，并且HⅠF-1α和CA-ⅠX可作为早期喉癌单纯放疗后肿瘤残留的预测指标。Shen等[27]研究发现同时抑制HⅠF-1α和GLUT-1的表达可降低裸鼠喉癌细胞模型的微血管密度，促进其凋亡和坏死，提高裸鼠移植喉癌细胞对放疗的敏感度。路秀英等[28]的研究发现对HⅠF-1α和信号转导及转录激活因子(signal transducers and activator of transcription，STAT3)信号途径联合抑制较单独抑制其中一种信号途径更能提高喉鳞状细胞癌裸鼠移植瘤对放疗的敏感度。推测HⅠF-1α和STAT3信号途径相互作用影响喉癌对放疗的敏感度。HⅠF-1α作为低氧应激反应的重要因子，可通过调控其靶基因的表达及与其他信号通路相互作用，促进肿瘤的进展，增强喉癌放射抵抗性，降低放疗治疗敏感度。

3.2 HⅠF-1α与喉癌的化疗 多药耐药是限制化疗疗效的主要问题，缺氧诱导HⅠF-1α的高表达在这一过程中起着重要作用。Li等[29]研究发现低氧可抑制化疗药物诱导的细胞凋亡，降低喉癌细胞对化疗药物的敏感度，而下调HⅠF-1α的表达可抑制体外缺氧条件诱导喉癌细胞耐药性的获得。国内徐鸥等[30]的实验得到了相似的结果。经典的多药耐药表型是由多药耐药(multidrug resistance 1，MDR1基因)/P-糖蛋白(MDR1/P-glycoprotein)的表达决定的。Jin等[31]研究发现在喉鳞状细胞癌中HⅠF-1α和MDR1/P-gp的表达明显增加，抑制HⅠF-1α的表达可下调MDR1基因的表达。提示在喉鳞状细胞癌中HⅠF-1α可能是缺氧诱导MDR1基因表达上调的关键。在另一项实验[32]表明抑制MDR1/P-gp基因的表达可通过提高低氧条件下喉癌细胞内药物浓度，增强喉癌细胞对顺铂、吉西他滨、紫杉醇和多柔比星(阿霉素)等多种化疗药物的敏感度，使其凋亡率增加。这些研究结果表明HⅠF-1α在低氧条件下调控喉癌细胞能量依赖性跨膜蛋白MDR1/P-gp的表达，降低喉癌细胞内药物积聚，是介导低氧诱导的喉癌细胞多药耐药性的关键调节因子。抑制HⅠF-1α的表达可提高低氧条件下喉癌细胞对化疗药物的敏感度。

3.3 HⅠF-1α靶向治疗与喉癌 大量研究证实HⅠF-1α的高表达可通过影响下游靶基因的表达促进肿瘤的进展，影响肿瘤对放化疗的敏感度。自20世纪90年代开始，学者们就注意到HⅠF-1α靶向治疗肿瘤的潜在价值。目前，针对HⅠF-1α靶向治疗的研究大致可分为影响HⅠF-1α mRNA和蛋白的表达及稳定性、抑制HⅠF-1二聚体形成及影响HⅠF-1α与其靶基因结合等方向[33]。无论是直接或间接影响HⅠF-1α的表达水平，均可较高改善肿瘤对放化疗的敏感度。路秀英等[34]报道，应用HⅠF-1α反义寡核苷酸靶向抑制HⅠF-1α基因可抑制HⅠF-1α mRNA和蛋白质的表达，提高喉癌细胞对放化疗的敏感度。在过去的几十年里，包括小分子、甾体、肽和天然产物衍生物等大量HⅠF-1α抑制剂被发现，一些已被批准的药物已经直接或间接地证明了HⅠF-1α抑制剂的作用，但目前尚无可靠的HⅠF-1α靶向药物应用于临床[35]。由于HⅠF-1α复杂的调控机制，研究HⅠF-1α特异性抑制剂仍然是目前较大的挑战。相信随着研究的进一步深入，HⅠF-1α靶向药物联合放化疗的非手术治疗模式在保留喉癌患者喉功能的前提下提高总体生存率将成为可能。

4 HⅠF-1α在喉癌中的预后价值

HⅠF-1α在喉癌中的预后价值尚存在争议。一项关于头颈部肿瘤(head and neck cancer，HNC)组织中HⅠFs表达荟萃分析[36]中显示HⅠF-1α可能是一个存在种族差异的预后因素，在亚洲患者中HⅠF-1α过度表达与预后不良显著相关，而欧洲患者HⅠF-1α过度表达与预后无关。而且在不同的HNC亚型中具有不同的预后价值,HⅠF-1α过表达与口腔癌、鼻咽癌、口咽癌预后显著相关，与喉癌的预后无相关性。Cabanillas等[37]用免疫组织化学检测106例行肿瘤切除和双侧颈淋巴结清扫术治疗的声门上型喉鳞癌组织中HⅠF-1α的表达情况，并分析其在预后的指导意义，发现HⅠF-1α在声门上型喉鳞状细胞癌手术治疗中的表达不具有预后价值。而王丽等[15]分析100例(声门区42例、声门上区56例、声门下区2例)喉癌患者癌组织HⅠF-1α及GLUT-1表达与预后的关系，这些喉癌患者均行喉癌术后辅助放疗，发现HⅠF-1α及GLUT-1高表达与患者预后效果不良密切相关。Schrijvers等[38]分析仅行放疗的早期(T1-T2)声门型喉鳞状细胞癌患者HⅠF-1α的表达与预后的关系，发现早期声门型喉鳞状细胞癌HⅠF-1α过表达与局部控制差和总生存率相关。而他们的另一项[39]对同样行放疗的早期(T1-T2)声门上型喉鳞状细胞癌患者研究却发现了不同的结果：HⅠF-1α对早期(T1-T2)声门上型喉鳞状细胞癌局部控制缺乏预后指导意义。这些研究结果表明HⅠF-1α在声门上型和声门型喉鳞状细胞中可能存在不同的预后指导价值。胚胎发生上的差异、周围结构对肿瘤扩散屏障作用的不同以及分化程度和颈淋巴结转移率发生的高低可能是造成HⅠF-1α在声门上型和声门型喉鳞状细胞癌不同预后指导价值的原因。

综上所述，HⅠF-1α作为实体肿瘤细胞发生低氧应激反应的重要标志物，可通过调控其靶基因促进新生血管及淋巴管形成、调节喉癌细胞的能量代谢，推动喉癌的发生、发展。HⅠF-1α的高表达与喉癌治疗抵抗有关，抑制HⅠF-1α可增加喉癌细胞对放化疗的敏感度。然而目前尚无可靠的HⅠF-1α靶向药物应用于临床，HⅠF-1α特异性抑制剂的研究仍然是目前亟须解决的问题。HⅠF-1α在声门上型喉癌和声门型喉癌中的预后指导意义的差异还需更多的研究证实。HⅠF-1α与喉癌的关系值得进一步研究。相信随着研究的进一步深入，未来HⅠF-1α可被用作喉癌的可靠诊断标志物和治疗的靶蛋白之一。