流行性乙型脑炎发病机制的研究进展

但美伶 尹榕

流行性乙型脑炎简称乙脑，又称为日本脑炎（Japanese encephalitis，JE），是由嗜神经性病毒乙脑病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的中枢神经系统的急性炎症，由虫媒传播。乙脑具有季节性和地域性，目前主要分布在东南亚及西太平洋的24个国家，约有30亿人生活在乙脑流行区域，每年报道约6.8 万乙脑临床病例，病死率为25%～30%，30%～50%的乙脑幸存者遗留严重的神经系统后遗症，给社会和公共卫生带来沉重负担[1]。

1 乙脑病毒结构及基因型

乙脑病毒属于黄病毒科黄病毒属，是一种含有包膜的正向单链RNA 病毒，在人类中具有神经侵袭性和神经毒性。该病毒具有3种结构蛋白：衣壳蛋白（C）、前体膜蛋白（M）和包膜蛋白（E），以及7个非结构蛋白：NS-1、NS-2A、NS-2B、NS-3、NS-4A、NS-4B 和NS-5[1，2]。目前确定了乙脑病毒的5种基因型，分别命名为G-Ⅰ、G-Ⅱ、G-Ⅲ、G-Ⅳ、G-Ⅴ。一项小鼠模型的中和试验和被动免疫研究表明，感染属于G-Ⅰ、G-Ⅱ、G-Ⅲ或G-Ⅳ病毒中任何一种病毒可以赋予交叉基因型免疫保护。另外，乙脑病毒基因型之间存在竞争性置换，即在某个区域一种基因型部分或完全替代另一种基因型，但这种竞争性置换的机制目前尚不清楚[3]。

2 乙脑的发病机制

2.1 病毒的复制人类被携带乙脑病毒的蚊虫叮咬后，病毒首先在局部皮肤和淋巴结中复制，引起短暂的低病毒血症。在潜伏期，乙脑病毒主要在单核-巨噬细胞和树突状细胞中复制[4]。然后，被感染的细胞从外周迁移至中枢，导致乙脑发生[5]。

乙脑病毒通过受体介导的胞吞作用进入细胞。非结构蛋白（NS），如NS-1、NS-2A、NS-2B、NS-3、NS-5等在病毒复制及装配过程中扮演重要角色[2，6，7]。信号肽酶复合物亚基1（SPCS1）是调节黄病毒复制的宿主因子，通过与NS-2B 相互作用影响病毒复制，进而影响乙脑病毒蛋白的加工翻译和病毒装配[6]。另外，宿主内质网在病毒基因组的复制和病毒体颗粒的成熟中也起着非常重要的作用[7]。

宿主microRNA 能直接靶向作用于病毒的mRNA，既能抑制病毒基因组的翻译，防止病毒复制，也可以稳定病毒RNA，增强复制。Chen 等[8]发现人工转染miR-33a-5p 模拟物后导致乙脑病毒复制显著减少，并进一步证实了miR-33a-5p 通过靶向抑制真核翻译延伸因子1A1(EEF1A1)的细胞内水平来抑制病毒复制。而Sharma 等[9]的一项研究表明miR-146a 的外源性过表达可导致感染乙脑病毒时Jak-STAT 途径被抑制，从而导致干扰素诱导基因（IFIT-1 和IFIT-2）的下调，促进病毒的复制。

此外，Huang 等[10]研究表明，CW-33（一种呋喃喹啉的中间体合成衍生物）可抑制乙脑病毒复制并触发Akt 激活，Akt 调节内质网中Ca2+的释放，减少Ca2+介导的细胞凋亡。

2.2 免疫机制乙脑病毒从血液中进入中枢神经系统，并快速引发体液和细胞介导的免疫反应，乙脑患者的临床表现和预后取决于病毒的毒力和宿主免疫反应。研究发现，先天性和适应性免疫反应在减少病毒血症和清除病毒中都非常重要[11]。

2.2.1 先天免疫反应 小胶质细胞和星形胶质细胞是中枢神经系统的两种重要细胞，它们在乙脑病毒感染过程中有助于宿主产生先天免疫力。据报道，小胶质细胞和星形胶质细胞在病毒感染期间，可上调一系列趋化因子，如CCL2（单核细胞趋化蛋白，MCP-1），CCL5（RANTES），CXCL10（干扰素γ 诱导蛋白，IP-10）等，这些趋化因子能以自分泌的形式刺激中枢神经系统中其他白细胞迁移，从而增强其他可能具有神经毒性的介质的分泌[12，13]。作为先天免疫的一部分，IFN-α是一种因病毒感染产生的糖蛋白细胞因子，它不直接抗病毒，而是诱导细胞中产生效应蛋白，从而抑制病毒的复制、组装或释放[11]。

2.2.2 适应性免疫反应

2.2.2.1 体液免疫 已有文献[11]报道了体液免疫反应在调控乙脑病毒感染及其传播过程中的作用。乙脑患者血清和脑脊液中产生IgM 抗体来对抗这种原发性感染。抗体可能在病毒免疫阶段(即病毒越过血脑屏障到达中枢神经系统之前的阶段)限制病毒的复制来保护宿主。IgM 抗体水平高往往提示预后良好。另外，识别主要位于病毒E 蛋白表位的中和抗体参与了这种体液免疫，这些抗体抑制病毒在细胞内的附着、内化和复制。表明针对E 蛋白的单克隆抗体的被动转移可以保护小鼠免受乙脑病毒的侵害。除此之外，抗NS-1 和抗前体膜蛋白（PrM）在介导针对乙脑病毒感染的保护性免疫中也发挥着重要作用[11]。

2.2.2.2 细胞免疫 细胞免疫在乙脑中的作用机制目前尚不清楚。在一项小鼠的白细胞迁移抑制试验中观察到小鼠T细胞的被动转移赋予了终生细胞免疫能力[11]。在另一项研究中，证明用灭活的乙脑疫苗免疫可在体内诱导T细胞活化[14]。这表明灭活的乙脑疫苗诱导的保护性免疫包括乙脑病毒特异性T细胞以及具有多种生物学活性的抗体。以上关于乙脑的动物实验表明，细胞免疫限制了病毒复制并保护了中枢神经系统免受病毒入侵。

在乙脑患者中分离出病毒特异的CD4+和CD8+T淋巴细胞，并发现它们可随着乙脑病毒的刺激而增殖，并且高质量的多功能CD4+T细胞反应提示与完全康复具有相关性。乙脑病毒感染可诱导CD8+T细胞应答的抑制，可能会增加宿主的易感性[11]。此外，DNA 或活疫苗诱导的最佳抗体反应完全取决于CD4+Th 细胞的存在[15]。对于感染乙脑病毒，不同个体临床反应和疾病进展具有差异，这可能与T细胞反应的遗传或种族差异有关，这将对于未来疫苗的研发起到重要的提示作用[11]。

T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域1（TIM-1）作为病毒入侵的辅助因子可促进乙脑病毒的感染。乙脑病毒和TIM-1 之间的相互作用可能直接影响免疫应答过程中的抗原提呈[16]。乙脑病毒通过MyD88 依赖性和非依赖性途径诱导树突状细胞功能损伤，继而导致较差的CD4+和CD8+T细胞反应，提高了病毒的存活率和在体内传播效率。TLR2-MyD88 和p38 MAPK 信号通路可能参与乙脑病毒介导的可溶性和细胞相关抗原交叉提呈的抑制[4]。另一项小鼠模型研究表明，在乙脑感染期间，髓样抑制细胞（MDSC）的数量增加，这些细胞会抑制T滤泡辅助细胞介导的免疫反应，削弱免疫应答，从而促进疾病的进展[17]。

2.3 血脑屏障破坏乙脑的特征在于中枢神经系统的广泛炎症和血脑屏障的破坏。乙脑病毒通过内皮细胞吞噬作用穿过血脑屏障，进入中枢神经系统，在神经元中传播，并诱导炎性细胞因子和趋化因子的产生，引起血脑屏障的破坏。

血脑屏障的破坏不是病毒本身造成的，在感染乙脑病毒的小鼠模型中，中枢神经系统中产生大量趋化因子和细胞因子，包括CXCL10、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、TNF-α、IL-6 和IFN-γ 等，并通过以下两种途径调节血脑屏障的通透性。首先，炎症细胞因子或趋化因子可通过下调紧密连接蛋白降低血脑屏障的通透性。其次，炎性细胞因子可以通过诱导黏附分子在血脑屏障内皮细胞上的表达来进一步损害血脑屏障。炎症介质IFN-γ下调了紧密连接蛋白的表达，在破坏血脑屏障通透性的过程中起核心作用[18]。

2.4 神经炎症神经炎症是乙脑病毒感染的标志。乙脑病毒感染可诱导促炎细胞因子的表达，引起人类急性脑炎。一般认为，乙脑发病机理很大程度上是宿主神经元免疫系统炎症反应失调的结果。感染乙脑病毒的细胞显示出LCFA（长链脂肪酸）β氧化受损，IL-6 和TNF-α 表达增加。积累的LCFA 触发氧化应激，激活NF-κB（核转录因子），诱导促炎性细胞因子产生，随后可能会导致与乙脑相关的脑损伤[19]。

据报道，乙脑病毒可双向引起神经元细胞死亡。首先，在神经元细胞内进行病毒复制直接导致细胞死亡。其次，间接杀伤，即小胶质细胞、星形细胞和募集的巨噬细胞过度激活导致释放过量的促炎细胞因子，如IL-6、TNF-α 和RANTES 等，增加血脑屏障的通透性，并促使大量白细胞迁移至中枢神经系统进而导致神经元细胞死亡[20]。

单核细胞、巨噬细胞和小胶质细胞在乙脑引起的中枢神经系统炎症中起主要作用。人小胶质细胞参与乙脑病毒的复制及储存，被称作病毒库。乙脑病毒对人小胶质细胞没有致病性，但能以接触传播的方式将病毒传给易感细胞。小胶质细胞在神经元病病理中起关键作用，具有促炎性（M1）或抗炎性（M2）双重作用，可导致神经毒性反应或神经保护功能。要有效地去除病原体，就需要早期的小胶质细胞活化。但是，长时间的小胶质细胞活化会导致促炎性介质的过量产生，进而导致神经炎症的发生[21]。

过度刺激谷氨酸受体，尤其是神经元N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)，可引起神经毒性反应。Chen 等[22]发现，乙脑病毒通过增加NMDAR 亚基（NR1 和NR2）的磷酸化和触发Ca2+的内流来激活NMDAR，Ca2+的内流引起钙蛋白酶和其他蛋白酶介导的细胞骨架损伤反应激活，并伴有活性氧产生，线粒体功能障碍，最终导致神经元细胞凋亡。因此，NMDAR 在调节乙脑病毒诱导的神经元细胞损伤和神经炎症中起着至关重要的作用。

3 乙脑的治疗

疫苗接种目前仍是预防乙脑最经济、最有效的手段。现阶段使用的乙脑疫苗主要有三种:鼠脑灭活疫苗、细胞培养灭活疫苗和细胞培养减毒活疫苗。目前广泛认可的疫苗是源自小鼠脑或细胞培养物的灭活疫苗，SA14-14-2 株在我国广泛使用，并认为对所有基因型均具有较好的保护效果[11，23]。

microRNA 对乙脑病毒复制的调控目前主要集中于抗病毒通路Jak-STAT，调控Jak-STAT 通路或许是抑制病毒复制的有利的研究方向[9]。NMDAR拮抗剂MK-801（地卓西平）可阻止乙脑病毒诱导的神经元细胞凋亡、谷氨酸和炎性细胞因子的产生，最终对急性脑炎提供保护作用，并降低感染乙脑病毒小鼠的死亡率[22],因此，NMDAR 靶向治疗可能成为控制乙脑的有效方法。有报道Ca2+抑制剂可在病毒进入、复制阶段起到抑制病毒的作用，可拮抗乙脑病毒活性，被认为是一种有效的治疗方法[24]。

一项研究表明，米诺环素可降低感染乙脑病毒小鼠的神经元凋亡、小胶质细胞活化、胱天蛋白酶活性、促炎介质释放和病毒滴度，表明米诺环素可以作为乙脑患者临床试验的候选药物[25]。Ye 等[26]证实了依那西普可减轻由乙脑病毒引起的炎症反应，并显著提高小鼠的存活率。尼泊尔一项随机双盲对照试验发现，静脉注射丙种球蛋白会使IL-6、IL-4 升高，通过调节体液免疫的方式减少神经系统后遗症的发生[27]。但这些药物都不能达到完全治愈小鼠的目的，还需要进一步的研究来评估联合用药是否能达到最佳疗效。

4 小结

乙脑的发病与流行一直是困扰我国及其他大多数亚洲国家的严重公共卫生问题。由于缺乏有效的药物治疗，使得乙脑的防治成为一项难题。为了不断探索新的治疗方案，关于乙脑发病机理的研究一直以来既是热点也是难点，涉及病毒复制、免疫反应、血脑屏障破坏、神经炎症等方面，并提出了众多干预策略。虽然我们在对乙脑发病机制的研究上有了较大进展，但用于人类治疗的临床药物的开发却滞后。目前部分药物（米诺环素、依那西普等）被认为能改善乙脑病毒感染小鼠的致死性结局，但仍缺乏大量的临床研究,而且尚不能达到治愈的效果。因此，仍有必要进行更多的临床药物的研发及评估联合用药是否能达到最佳治疗效果。