Wnt信号通路、靶向降解技术与心力衰竭治疗的新进展

康伊，张伟，孙蔚雯，王晶，张艳，逯春鹏

Wnt信号在生物体发育过程中的作用至关重要，同时也在多种病理过程中发挥了关键作用（如神经退行性变、骨质疏松和癌症）。诸多研究表明，Wnt信号在心脏重构和心力衰竭（心衰，HF）等病理过程中被显著激活。本文主要介绍Wnt信号通路及其调控机制，总结Wnt信号通路参与心肌肥大的病理过程。在此基础上，前瞻性地介绍利用降解靶向嵌合体（PROTAC）技术和溶酶体降解技术的基本原理，探讨将靶向降解技术用于调控Wnt信号转导通路的治疗心力衰竭（心衰）等心脏相关疾病的前景。

心衰是由于心脏结构或功能异常导致心室充盈或射血能力受损的一组临床综合征，是各种心脏疾病的严重和终末阶段，临床表现为呼吸困难，液体潴留，组织灌注减少，致死性心律失常或泵不足等现象[1]。其发病率高，有临床症状患者的5年存活率与恶性肿瘤相仿。据国外统计，人群中心衰患病率约1.5%～2.0%，且过去40年中，心衰导致的死亡增加了6倍。我国对35～74岁居民抽样调查中发现慢性心衰患病率为0.9%，慢性心衰患者约有400万人，已成为21世纪我国心血管病领域的突出问题[2]。

Wnt基因是从小鼠乳腺癌中克隆的一种原癌基因，是由脂质修饰的糖蛋白。目前，已在人类中分离、鉴定了19种Wnt配体。Wnt配体分为两类，即Wnt1类和Wnt5a类。Wnt1类激活Wnt经典信号通路，包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8及 Wnt8a；Wnt5a类激活非经典信号通路，包括Wnt 4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a和Wnt11[3]。参与Wnt信号通路的受体蛋白包括Frizzled（Fzd）受体、LRP5/6受体及下游信号分子糖原合成酶激酶3β（GSK3β）、β-catenin、散乱蛋白Disheveled（Dsh）、T细胞因子/淋巴样增强因子（Tcf/Lef）、细胞支架轴蛋白（Axin）等[4]。

1 Wnt信号通路的基本情况

Wnt/Fzd受体复合物能激活多种信号通路，主要分经典Wnt信号通路、平面极性（PCP）信号通路和Ca2+信号通路[5]。目前研究最清楚的途径是β-catenin介导的经典Wnt信号，其中β-catenin作为信号转导的第二信使。在静息状态下，β-catenin被一种 “降解复合物”的蛋白质复合物磷酸化，进而被泛素-蛋白酶体途径降解，从而维持细胞内Wnt信号通路处于未激活状态。哺乳动物的Wnt信号通路降解复合体是由APC蛋白，Axin，CK1和GSK3β共同组成的。当细胞外的Wnt蛋白配体与细胞膜受体Fzd、LPRP5/6结合时，细胞内的Dishevelled蛋白就会被募集到细胞膜，进而将降解复合物募集到细胞膜附近并将其打散。这导致细胞浆内的β-catenin蛋白摆脱了被降解的命运，在细胞质内大量积累，并依靠自身携带的入核信号转位进入细胞核，入核后β-catenin蛋白与转录因子TCF/LEF结合，介导了一系列经典Wnt信号通路的靶基因表达[6]。

除β-catenin介导的经典Wnt信号通路外，Wnt蛋白配体还可激活PCP信号通路和Ca2+信号通路。PCP通路主要控制细胞相对于邻近细胞的方向。非经典Wnt信号配体结合Fzd和ROR2/RYK等辅助受体后，招募Dsh蛋白富集到细胞膜，进而激活两种小GTP激酶：Rho和Rac，而Rac-GTP酶进一步激活c-Jun 氨基末端激酶（JNK），发挥调控微管蛋白等细胞骨架的作用。Wnt/Ca2+信号通路通过Wnt5a和Wnt11激活G蛋白激活磷脂酶C（PLC）和蛋白激酶C（PKC），引起细胞内Ca2+浓度增加和Ca2+敏感信号成分激活，以调节细胞运动和细胞黏附性，此通路能拮抗经典的Wnt信号通路[7,8]。

2 Wnt 信号通路参与心力衰竭

心肌肥大是心脏的一种代偿反应，主要特征是心肌细胞体积增大。心肌细胞是终末分化的细胞，当心脏面临负荷增加或损伤时，它们的增殖率就会不足[9]。因此，心肌细胞对这些挑战的反应主要是肥大生长。心肌细胞肥大可以源于生理刺激反应（如运动或怀孕），也可能源于病理刺激（如高血压或瓣膜缺陷）。容量过载（如瓣膜缺陷引起）会导致偏心性或外向性肥厚，而主动脉狭窄或高血压引起的压力过载会导致向心性或内向性肥厚。当向心性肥厚的根本原因得不到治疗时，就会演变成偏心性重构，通常称为扩张型心肌病[10]。

研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在心肌肥大中起到重要作用。Malekar等[11]实验表明，经典Wnt信号通路在Dsh过表达转基因小鼠中激活，Dsh过表达小鼠出生3个月后出现严重的心肌肥大表型，心肌细胞体积明显比正常小鼠增大且过早死亡；相反，在Dsh敲除的心肌细胞中β-肾上腺素诱导的心肌肥大反应受到抑制。在压力超负荷下，抑制GSK3β的丝氨酸9位点磷酸化降低了小鼠心肌肥大和心衰的发生率[12]。β-catenin敲除的杂合成年小鼠心脏重量和心脏重量与体重比，均低于β-catenin基因完整组小鼠，表明细胞质中β-catenin促进肥大反应[13]。研究还表明，非经典Wnt通路也与心肌肥大有关。JNK在心肌肥大中起重要作用，MKK7D转基因小鼠心脏左右心房均变大，而MKK7D表达显著激活JNK表达[14]，Dsh过表达的心肌肥大小鼠体内Wnt/PCP信号通路和Wnt/Ca2+信号通路均被激活[11]。

许多心血管疾病均会导致心衰，心衰是各种心脏疾病导致心功能不全的一种综合征，是多种心血管疾病的最终病理变化。在几项针对人类心衰的研究中，观察到了与sFRPs蛋白水平升高的联系。在衰竭的人类心脏中观察到sFRP3和sFRP4的mRNA水平增加，而不是sFRP1和sFRP2，且与β-catenin水平降低有关[15]。最近Askevold等证实了sFRP3表达的增加，他们还报告了心衰患者血清中sFRP3水平的增加与心血管死亡率相关[16]。这些观察结果表明，内源性Wnt拮抗剂的表达抑制了心衰时的Wnt信号传导。

必须注意的是，在142例心衰患者的1年随访中，sFRP3水平与心血管事件发生之间的相关性并未达到统计学意义[17]。相比之下，Hou等最近发表了关于人类和小鼠衰竭心脏中经典Wnt信号激活的证据。在这项研究中，β-catenin的核积累和转录因子TCF7L2的激活导致c-Myc的表达增加—心脏应激期间表达的Wnt靶基因[18]。Dapper1（Dpr1）是核质穿梭蛋白在细胞核内抑制Wnt信号，上调的Dpr1作用于上游Dsh2激活经典Wnt信号通路诱导心肌重构，使小鼠左室收缩和舒张功能受损[19]，Haq等研究表明，心衰患者心脏中GSK3β被抑制[20]。此外，心脏特异性过表达Dsh的小鼠中经典和非经典Wnt信号通路均被激活，Dsh过表达引起小鼠心肌肥大、心衰和过早死亡[11]。以上研究表明，Wnt信号通路在心衰过程中还存在相互矛盾的研究结果，需要更多更精确的体内研究来进一步研究论证。

3 靶向降解技术

诸多人类遗传学研究表明，许多新的靶蛋白通过获得功能性毒性而引起疾病。传统的药物开发策略需要占据结合位点进而抑制目标蛋白功能活性，这使得支架蛋白、转录因子和其他非酶蛋白等与疾病相关的蛋白靶点都变得“不可成药”。通过人工调控泛素—蛋白酶体系统和自噬—溶酶体系统，可通过细胞内的质量控制系统纠正或降解“不可成药”的致病蛋白质[21]。目前，通过靶向降解技术调控Wnt信号通路的活性，已经取得了部分突破性研究进展。

3.1 PROTAC降解技术目前小分子诱导蛋白降解的主要方法是降解靶向嵌合体技术（PROTAC）。PROTAC分子通过拉近靶蛋白和E3连接酶的距离从而提高靶蛋白的泛素化效率，进而诱导蛋白酶体系统对靶蛋白进行降解。但同时，PROTAC技术存在一定局限性，比如该方法依赖特定E3连接酶，限制其在某些细胞中的应用；其分子量普遍偏大，成药性存在一定问题等[21]。

2001年，Crews和同事为PROTAC技术提供了概念性证据。他们合成了一个名为Protac-1的嵌合大分子，将MetAP-2招募到Skp1-Cullin-Fbox复合物，以剂量依赖性方式导致MetAP-2蛋白泛素化和降解[22]。然而，MetAP-2共价结合部分是一个肽，阻碍了嵌合大分子进一步的应用，因为它的大分子尺寸导致细胞渗透性差。2015年，Brader研究团队又建立了一个重要的基于cereblon蛋白（CRBN）的PROTAC系统[23]。另一个PROTAC系统，基于HIF1-α介导的VHLPROTAC系统肽，最初于2004年引入[24]。2015年，通过羟脯氨酸样小分子替代VHL靶向肽，使得VHL-PROTAC系统的亲和性和特异性显著提高，极大地扩展了其应用[25]。目前虽有大于600个已知的人类E3连接酶，但已建立的依赖E3连接酶PROTAC系统不到10个，应用最广泛的有CRBN[26]、VHL[25]、cIAP[27]和MDM2[28]。

3.2 溶酶体降解技术除了泛素-蛋白酶体途径外，细胞内蛋白质的降解还可以通过自噬-溶酶体途径。利用溶酶体降解途径降解“不可成药”的蛋白质靶点也具有广泛的开发前景。溶酶体降解途径包括内体/溶酶体途径和细胞自噬途径。细胞自噬途径始于被称为自噬体的分离膜结构，该结构来自具有脂质化LC3蛋白的脂质双层膜，自噬体通过膨胀进而吞噬蛋白质和其他生物分子，甚至包括细胞器等细胞内物质，这些物质被隔离在闭合的双膜囊泡中，随后被降解[21]。

自噬靶向嵌合体（AUTAC）采用与PROTAC类似的设计，很适合降解胞质中对PROTAC分子具有抗性的目标蛋白。货物蛋白首先被吞噬形成自噬体，然后SQSTM1/p62等自噬受体识别Lys63（K63）多聚泛素化货物蛋白，并将它们转移到自噬体进行降解。AUTAC和PROTAC分子均通过泛素化起作用，但AUTAC分子通过触发K63多聚泛素化从而诱导靶标降解。研究发现AUTAC分子具备降解目标蛋白以及受损的线粒体等细胞器的能力[29]。

自噬体偶联化合物（ATTEC）则是利用自噬降解目标蛋白的一种更直接方法。ATTEC分子与PROTAC和AUTAC分子不同，不依赖底物的泛素化。ATTEC分子直接将目标蛋白和自噬体关键受体LC3结合在一起，促进目标蛋白被自噬体吞噬。研究表明，自噬体偶联化合物可以在细胞或者动物模型体内降解具有重复扩展的多聚谷氨酰胺（polyQ）的mHTT（突变的亨廷顿蛋白），并减弱HD相关的表型。ATTEC分子可以和polyQ特异性相互作用从而选择性降解mHTT且不影响野生型HTT水平。ATTEC分子还能够降解其他引起疾病的polyQ蛋白。通过直接与自噬体蛋白LC3相互作用并绕过泛素化过程，ATTEC分子在降解DNA/RNA分子、受损的细胞器等通过自噬识别的非蛋白货物方面具有巨大潜力，但ATTEC分子是否会影响整体自噬活性还有待研究[30,31]。

4 靶向降解技术调控Wnt信号通路用于治疗心衰

利用靶向降解技术精确地调控Wnt信号通路活性，进而用于治疗心衰等心脏疾病，已经显示出了初步的前景。陈晔光院士研究组利用PROTAC技术，成功合成了基于与β-catenin结合的Axin衍生肽，发现两种订书钉肽SAHPA1和xStAx分别增强或削弱Wnt/β-catenin信号，通过将SAHPA1或xStAx与VHL配体偶联来设计PROTACs，以实现高效的β-catenin蛋白降解。所获得的xStAx-vhl可在体内维持β-catenin的降解，并且对癌细胞和APC-/-类器官中的Wnt信号具有强烈的抑制作用。更重要的是，xStAx-vhl可潜在抑制结直肠癌患者来源的类器官存活。结果表明，xStAxvhl突出了β-catenin降解物PROTACs作为一类新型抗癌药物的潜力[32]。对于xStAx-vhl通过降解β-catenin蛋白下调Wnt信号通路的活性，在治疗或延缓心肌肥大的过程是否具有重要作用，需进一步研究。同时，利用两种特异性的小肽分子还可更加精细地研究经典Wnt信号通路在体内心衰程中的详细机制。

除β-catenin外，Wnt信号通路中还有其他重要蛋白通过靶向降解技术进行调控。Dsh蛋白可同时调控经典和非经典Wnt信号通路，研究表明，Dsh蛋白可通过细胞自噬途径进行降解，且Dsh蛋白的聚集化对于调控Wnt信号功能和自身质量控制十分关键[33]。能否通过设计自噬体偶联化合物（ATTEC），实现在体内降解调控Dsh蛋白，精确调节Wnt信号通路，从而治疗心肌肥大、心衰及心肌梗死后的创伤愈合等病理过程，有待深入研究。此外，Axin蛋白作为β-catenin蛋白降解复合物的关键蛋白，既可通过泛素—蛋白酶体途径降解，也可通过自噬—溶酶体途径降解，通过设计特定的PROTAC或者ATTEC小分子化合物，也能实现精确调控Wnt信号通路的功能。

综上所述，Wnt信号通路在心肌肥大、心肌梗死后伤口愈合等病理过程中的作用，研究十分明确，而在心衰病理过程中的作用仍需进一步研究阐明，靶向蛋白降解技术作为精确调控Wnt信号通路的有效手段，未来在治疗心衰等心脏相关疾病中必将大有作为。