大蒜素通过调控SIRT3/PPARγ信号通路促进心衰大鼠血管再生和心功能改善

赵静，赵颖，李晗

心力衰竭（心衰，HF）是心脏终末期的疾病，促进血管生成可恢复心肌组织细胞新生，减少凋亡和纤维化[1,2]。Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶（Sirtuins3，SIRT3）是线粒体功能和细胞代谢的新型调节剂，SIRT3通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）促进梗死后的心肌组织中的血管新生[3]。大蒜素是一种来源于大蒜的含硫化合物，其生物学活性包括调节细胞免疫、抑制炎性反应以及调节氧化应激抗纤维化[4]。大蒜素可通过促进PPARγ缓解胰岛素抵抗[5]。临床研究显示大蒜中活性物质可以抑制同型半胱氨酸的水平并调节脂代谢，从而降低冠心病的发生风险[6]。最新一项细胞研究结果显示大蒜素具有缓解HF的作用[7]。本文主要分析大蒜素对HF大鼠血管再生和心功能的影响，分析其作用是否与SIRT3/PPARγ通路有关。

1 主要材料与方法

1.1 主要实验材料Sprague-Dawley（SD）大鼠（雄性，12周，220～250 g）。彩色多普勒超声诊断仪（型号：SmwScape-S2H，深圳开立公司，中国）。HE、Masson和TUNEL染色试剂盒购自武汉华美公司（中国）。显微镜（Olympus公司，日本）。酶标仪（Model 680，Bio-Rad，美国）。组织匀浆机（Thermo Fisher Scientific公司，美国）。TRIzol（Sigma公司，美国）。RNAspin Mini试剂盒（GE Healthcare，美国）。Bestar qPCR RT和Bestar™qPCR试剂盒（DBI Bioscience公司，德国）。Agilent Stratagene Mx3000P序列检测系统（Santa公司，美国）。一抗和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1：1000稀释，#ab6721）（Abcam公司，美国）。硝酸纤维素膜（EMD Millipore，美国）。ECL 显色试剂盒（Thermo Fisher公司，美国）。显微镜（Carl Zeiss公司，德国）。

1.2 分组、建模和干预HF大鼠模型根据参考文献[8]方法结扎腹主动脉构建，大鼠麻醉后切开腹膜并游离主动脉，利用4号手术线将8号针头和主动脉共同扎在一起（此步骤为避免结扎过紧），轻退针头，缝合伤口并行抗菌处理。8周后通过检测心功能判断建模结果。本研究死亡2只，建模成功49只，成功率81.67%。将45只HF大鼠随机分为HF组、HF+低剂量大蒜素组和HF+高剂量大蒜素组（n=15）。同期健康的、仅暴露主动脉不结扎的大鼠15只作为对照组。大蒜素的灌胃剂量分别为15 mg/kg·d和30 mg/kg·d[9]，连续21 d。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 心功能检测二维超声引导下的M型超声检测射血分数（EF）、左室舒张末期内径（LVEDD）、左室收缩末期内径（LVESD）。

1.3.2 HE染色大鼠心肌组织经固定、脱水、包埋后切成5 μm的切片，室温下放入苏木精中染色10 min。自来水洗涤1～2 min后反蓝，再次用自来水清洗1～2 min后，将玻片放入曙红中10 s，中性胶密封玻片，在倒置显微镜下观察载玻片。

1.3.3 Masson染色通过Masson染色检测纤维化情况。将1.3.2中的切片标本加入Masson三色染料进行染色，利用图IPP 6.0像分析系统计算胶原蛋白的体积分数（CVF）。

1.3.4 TUENL染色将切片标本置于45℃的烘箱中过夜。经过脱蜡和修复抗原后，加入蛋白酶K稀释液在37℃下孵育20 min。洗涤后加入TUNEL试剂在37℃下孵育60 min。PBS洗涤3次，5 min/次。干燥后，加入在荧光衰减剂并在荧光显微镜下观察并计算凋亡指数=TUNEL阳性的细胞数/总细胞数目×100%）

1.3.5 免疫组化染色通过免疫组化染色检测血管标志蛋白CD31的水平评估心肌组织中血管新生情况。将1.3.2中的切片标本在室温下用3%过氧化氢的甲醇溶液处理30 min，加入CD31的抗体（1：500稀释）一起孵育过夜，而后加入山羊抗兔IgG二抗（1：1000稀释）在室温下孵育2 h。用DAB处理样本，在×400倍视野下计算随机5个视野中血管数目。

1.3.6 RT-qPCR使用RNAspin Mini试剂盒从心肌组织中提取RNA，使用Bestar qPCR RT试剂盒将其逆转转录为cDNA，条件如下：37℃/15 min；98℃/5 min。使用Bestar™qPCR预混液进行qPCR实验，条件如下：95℃/2 min， 94℃/20 s，58℃/20 s，72℃/20 s，40个循环，72℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列检测系统进行RT-qPCR分析。通过比较循环阈值并以GAPDH作为内参计算mRNA相对表达水平。

1.3.7 Western blot将心肌组织在放射免疫沉淀测定裂解缓冲液中在冰上裂解。通过8%的SDSPAGE分离每个样品中等量（50 μg）的蛋白质，将其转移到硝酸纤维素膜上。封闭后将膜与一抗体在4℃下孵育过夜，将膜与相应的辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1 h。使用化学发光试剂显示，使用Quantum One软件分析灰度计算蛋白相对于GAPDH的表达量。

1.4 统计学处理统计分析使用SPSS 19.0软件。数据以平均值±标准偏差（SD）表示。多组间比较进行单因素方差分析，两两比较使用SNK-q检验。统计学显着性表示为P＜0.05。

2 结果

2.1 大蒜素对HF大鼠心功能的影响HF组的EF显著低于对照组，而LVEDD和LVESD显著高于对照组（P＜0.05）。HF+高剂量大蒜素组的EF显著高于HF+低剂量大蒜素组，且两组均显著高于HF组（P＜0.05）。HF+高剂量大蒜素组的LVEDD和LVESD显著低于HF+低剂量大蒜素组（P＜0.05），且二者均显著低于HF组（P＜0.05），表1。

表1 大蒜素对HF大鼠心功能的影响

2.2 大蒜素对HF大鼠心肌组织损伤的影响HF组大鼠心肌细胞染色不均匀，排列紊乱；HF+低剂量大蒜素组和HF+高剂量大蒜素组的心肌损伤情况较HF组有明显的缓解，且HF+高剂量大蒜素细胞排列有序，图1。

图1 HE染色检测大蒜素对HF大鼠心肌组织损伤的影响（×200）

2.3 大蒜素对HF大鼠心肌纤维化的影响结果显示四组的CVF水平比较差异显著，其中HF组的CVF（24.81%±2.25%）显著高于对照组（1.72±0.16%）（P＜0.05），HF+低剂量大蒜素组（14.57%±1.23%）和HF+高剂量大蒜素组大鼠的CVF（7.26%±0.89%）均显著低于HF组（P＜0.05），其中HF+高剂量大蒜素组显著低于HF+低剂量大蒜素组（P＜0.05），图2。

图2 Masson染色检测大蒜素对HF大鼠心肌纤维化的影响

2.4 大蒜素对HF大鼠心肌细胞凋亡的影响HF组的凋亡指数（24.52±2.41%）显著高于对照组（2.06±0.31%）（P＜0.05），HF+低剂量大蒜素组（15.64±1.98%）和HF+高剂量大蒜素组（8.17±1.03%）的凋亡指数均显著低于HF组（P＜0.05），其中HF+高剂量大蒜素组显著低于HF+低剂量大蒜素组（P＜0.05）。

2.5 大蒜素对HF大鼠心肌组织中血管生成情况的影响HF组的血管数目（19.21±2.26条）显著低于对照组（28.54±0.32条）（P＜0.05），HF+低剂量大蒜素组（34.78±4.02条）和HF+高剂量大蒜素组（57.25±6.32条）的血管数目均显著高于HF组（P＜0.05），其中HF+高剂量大蒜素组显著高于HF+低剂量大蒜素组（P＜0.05），图3。

图3 免疫组化染色检测大蒜素对HF大鼠心肌组织中血管生成情况的影响

2.6 大蒜素对HF大鼠心肌组织中SIRT3和PPARγ mRNA水平的影响HF组的SIRT3和PPARγ mRNA水平均显著低于对照组（P＜0.05）。HF+低剂量大蒜素组和HF+高剂量大蒜素组的SIRT3和PPARγ mRNA水平均显著高于HF组（P＜0.05），且HF+高剂量大蒜素组显著高于HF+低剂量大蒜素组（P＜0.05），表2。

表2 大蒜素对HF大鼠心肌组织中SIRT3和PPARγ mRNA水平的影响

2.7 大蒜素对HF大鼠心肌组织中SIRT3和PPARγ蛋白水平的影响HF组的SIRT3和PPARγ蛋白水平均显著低于对照组（P＜0.05）。HF+低剂量大蒜素组和HF+高剂量大蒜素组的SIRT3和PPARγ蛋白水平均显著高于HF组（P＜0.05），且HF+高剂量大蒜素组显著高于HF+低剂量大蒜素组（P＜0.05）。

3 讨论

心力衰竭目前是发达国家和发展中国家最严重的健康问题，缺血性心脏病、高血压、糖尿病、血脂异常和吸烟等因素均可增加发生HF的风险[10]，目前临床上尚无特效疗法。

大蒜素（2-丙烯-1-磺基硫磺酸S-2-丙烯基酯）是大蒜中的主要活性化合物，具有抗氧化、抗炎、抗纤维化、调控免疫等作用[11]。本研究发现大蒜素可剂量依赖性缓解心肌组织损伤，减少纤维化和细胞凋亡，提高心脏射血功能。此外，大蒜素可剂量依赖性的促进血管生成。心肌组织中的血管生成会提高供血供氧水平，进而抑制心肌细胞的凋亡并缓解纤维化，提高心功能[12]。Toyga等[13]研究显示大蒜素通过促进血管生成促进伤口愈合速度。本研究同时显示大蒜素可能通过促进血管生成减少HF大鼠心肌细胞的凋亡和纤维化，从而提高HF大鼠的心功能。

SIRT3可通过调控各种蛋白质脱乙酰化来调节细胞过程，研究显示其可通过促进PPARγ的表达缓解心肌损伤保护心功能[14]。内皮特异性SIRT3缺失会损害糖酵解和血管生成，且SIRT3可通过PPARγ促进血管生成[15]。大蒜素可剂量依赖性的提高SIRT3和PPARγ转录和翻译的水平，通过诱导SIRT家族蛋白的表达缓解过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞损伤[16]。Lin等[17]研究结果显示在暴露于氧化的低密度脂蛋白的泡沫细胞中，大蒜素处理激活了PPARγ相关信号传导，从而发挥抗炎和抗氧化功能，提示大蒜素促进HF血管生成的机制可能与SIRT3/PPARγ通路有关，通过提高心肌细胞中SIRT3和PPARγ的转录和翻译水平，促进血管生成相关基因的转录水平，促进血管生成。

综上所述，大蒜素可能通过剂量依赖性的诱导SIRT3/PPARγ通路促进血管生成，抑制心肌细胞凋亡和纤维化，提高心脏射血功能。但其具体作用和剂量仍需进一步的体内研究。