不同产地及炮制方法雪上一枝蒿中雪上一枝蒿甲素含量对比研究*

牛延菲，曹红云，徐 怡，张晓南，王 鹏，苏 钛

(1 西南林业大学化学与工程学院，云南 昆明 650224；2 云南省药物研究所，云南 昆明 650111)

雪上一枝蒿为毛茛科植物短柄乌头的干燥块根(拉丁名：AconitumbrachypodumDiels.)[1]。其味苦、辛，性温，有大毒[1]，主产于云南北部的东川、会泽等地，具有祛风镇痛的功效，用于治疗风湿疼痛、跌打损伤等症[2]。其化学成份包括生物碱和非生物碱两大类[3-4]，其生物碱成分主要为二萜类生物碱[5-8]，国内外学者[9-14]对雪上一枝蒿中生物碱成分进行了充分研究，发现了包括乌头碱、雪上一枝蒿甲素等在内的数十种生物碱；王洪云[4]、杨立国等[12]发现其非生物碱类成分有：β-谷甾醇、胡萝卜苷、多糖等其他成分。现代药理试验表明[15-17]，雪上一枝蒿具有镇痛、抗肿瘤、抗炎以及局部麻醉的药理作用，另外还有抗生育[18]、抑制呼吸系统兴奋的作用。

雪上一枝蒿为大毒药材，《云南中药志》言其：“本品有毒，未经炮制，不宜内服。”较准确地记载了其毒性。乌头类中药材毒性较强，须经炮制后入药。炮制后，乌头类中药材中的双酯型乌头碱会水解成毒性较小的单酯型乌头碱[5]，雪上一枝蒿除含有乌头碱等双酯型生物碱外，雪上一枝蒿甲素亦是其主要化学成分，目前鲜有雪上一枝蒿炮制前后雪上一枝蒿甲素含量测定的相关文献报道。

雪上一枝蒿甲素为二萜生物碱，作为雪上一枝蒿的主要活性成分，能够抗炎镇痛、抗肿瘤、抗心律失常、强心、抗生育[19-21]。从化学结构分析，雪上一枝蒿甲素为醇胺型二萜生物碱。为考察雪上一枝蒿甲素受地理因素和炮制方法的影响程度，在建立准确可行的测定方法基础上，对不同产地和不同炮制方式的雪上一枝蒿甲素含量进行测定和分析。此方法的开发，可为雪上一枝蒿的炮制工艺及饮片的质量标准提高提供更加有利的依据和参考价值。

1 仪器与材料

美国Agilent 1100高效液相色谱仪：四元泵；DAD检测器；自动进样器；在线真空脱气机；智能化柱温箱及Agilent化学工作站；DHG-9037A电热恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；AB204-N型电子天平，梅特勒-托利多；AG285型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；SK250HP超声仪，上海科导。

雪上一枝蒿甲素(批号：110895-200404，纯度以100%计)，购自中国食品药品检定研究院；色谱甲醇(批号：JA025830，色谱纯)，德国默克；氨水，甲醇，三氯甲烷，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾均为分析纯。

雪上一枝蒿药材采自云南东川、会泽、丽江，由云南省研究所正高级工程师高丽鉴定为毛茛科植物短柄乌头的干燥块根。

2 方法与结果

2.1 方法建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Waters Xterra C18柱(5 μm，4.6×250 mm)；流动相：pH 7.3磷酸盐缓冲溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按表1洗脱；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：210 nm；进样量：10 μL。

表1 流动相梯度

2.1.2 对照品溶液的制备

精密取甲素对照品适量，置于25 mL量瓶，加10 mL甲醇溶解后，用甲醇稀释至刻度，即得每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液制备

取本品粉末1.5 g，精密称定，置150 mL锥形瓶中，加1 mL氨试液，再精确移入50 mL三氯甲烷，回流2小时(80 ℃)，放至室温，用快速滤纸过滤，残渣洗涤4次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，减压蒸干(40 ℃以下)，残渣用甲醇定容至25 mL量瓶，混匀后，滤过，即得。

2.1.4 专属性与系统适用性

取供试品溶液和对照品溶液，同时准备空白溶液和加标溶液，按“2.1.1”项色谱条件进样。结果见图1。由图1可以看出供试品溶液与对照品溶液中雪上一枝蒿甲素在相同位置出峰，且空白溶液对含量测定无干扰，色谱峰的理论塔板数，分离度，对称因子均符合要求，表明本法具有良好的专属性和系统适用性。

图1 专属性试验HPLC图谱

2.1.5 线性关系

精密称取雪上一枝蒿甲素对照品适量(10.30 mg)，置25 mL量瓶，加10 mL甲醇溶解后，用甲醇稀释至刻度，即得每1 mL含0.1030 mg的储备液。精密吸取该储备液，逐级稀释，稀释浓度见表2，按“2.1.1”色谱条件进样，记录峰面积。以含量(X)对峰面积(Y)进行线性回归，得回归方程Y=674.37X+13.588，r =0.9999。结果表明，在上述色谱条件下，雪上一枝蒿甲素在0.0515～10.3000 μg范围内线性关系良好。

表2 线性关系考察结果

2.1.6 仪器精密度

取同一对照品溶液，按“2.1.1”项色谱条件进样，连续进样6针，记录峰面积计算相对标准偏差(RSD)，RSD值为0.5%(n=6)，结果表明仪器具有良好的精密度。

2.1.7 重复性试验

精密称取饮片6份，按供试品制备方法制备，按“2.1.1”项色谱条件进样。记录峰面积计算相对标准偏差(RSD)，RSD值为0.7%(n=6)，结果表明本法的重复性较好。

2.1.8 检测限和定量限试验

取“2.1.5”项下雪上一枝蒿甲素对照品溶液适量，以甲醇稀释配制成一系列浓度的混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，分别以3倍和10倍信噪比作为指标，考察检测限(LOD)和定量限(LOQ)，结果检测限为0.02575 μg，定量限为0.0515 μg。

2.1.9 准确度试验

精密取雪上一枝蒿甲素对照品适量(26.00 mg)，置入25 mL量瓶，加10 mL甲醇溶解后，用甲醇稀释至刻度，制成每1 mL含1.04 mg的溶液，即得。

精密称取9份供试品(已知含量为0.2859%)，每份约0.75 g，分别加上述对照品溶液1 mL、1 mL、1 mL、2 mL、2 mL、2 mL、3 mL、3 mL、3 mL，然后按供试品制备方法制备，按“2.1.1”项色谱条件进样，计算回收率。结果见表3，回收率在93.57%～100.55%之间，RSD值为3.0%(n=9)，回收率良好。

表3 加样回收试验

2.1.10 溶液稳定性试验

对溶液稳定性做了考察，取制备好的供试品溶液，按“2.1.1”项分别于0、2、6、8、16、24小时进样，以峰面积计算，RSD值为2.9%(n=6)，说明样品在24小时内稳定。

2.2 样品测定

2.2.1 不同产地药材含量测定

取不同产地的15批药材，按“2.1.3”项制备，按“2.1.1”项测定，结果见表4。结果表明，云南东川、会泽、丽江产区的雪上一枝蒿甲素含量在0.09%～0.33%之间，不同产地不同批次药材雪上一枝蒿甲素含量存在一定差异。

表4 15批样品测定结果

2.2.2 不同炮制方式含量测定

雪上一枝蒿为大毒药材，《云南中药志》言其：“本品有毒，未经炮制，不宜内服。”较准确地记载了其毒性。国内外学者对其炮制进行了大量研究，江林等对不同产地和不同炮制方法的雪上一枝蒿的总碱含量作了实验对比，发现水煮是最优的炮制方式。在实际生产中，考虑到安全和提取效果，多在投料前进行蒸煮炙，雪上一枝蒿药材中含有大量的双酯型生物碱，在进行蒸煮炙时，会转变成单酯型生物碱，以达到减毒增效的目的。

为考察不同炮制方式对雪上一枝蒿甲素含量的影响，对药材进行蒸(蒸至透心)、煮(煮至透心)、高压(121 ℃炮制15 min)炮制，使用不同温度(50 ℃、60 ℃、75 ℃、100 ℃、130 ℃、150 ℃)进行干燥，得18批雪上一枝蒿饮片，使用经验证的方法测定雪上一枝蒿甲素含量。

检测结果见表5。根据检测结果炮制前后含量变化不显著，说明雪上一枝蒿甲素不易受炮制工艺影响，该结论与其化学性质相吻合(醇胺型二萜生物碱，无酯基，不易水解)。

表5 不同炮制方法含量测定结果

3 结 论

雪上一枝蒿中主要化学成分为二萜生物碱，也是其毒性成分，生物碱在煎煮后毒性也会显著变小，其过程为乌头碱在煎煮条件下可水解生成毒性更小的次乌头碱，若继续煎煮次乌头碱可进一步发生水解成具有更小毒性的乌头原碱。雪上一枝蒿甲素属于二萜生物碱，能够抗炎镇痛，为雪上一枝蒿的主要活性成分。目前，全国没有统一的雪上一枝蒿炮制规范工艺，为考察雪上一枝蒿甲素是否会受到地理因素和炮制方法的影响，研究建立了准确可行的饮片中雪上一枝蒿甲素测定方法，比较了云南东川、会泽、丽江三个产区的药材含量差异，同时考察民间常用的炮制方式对其含量的影响。

研究结果表明，所建立的雪上一枝蒿甲素的测定方法，专属性、线性、准确度、精密度、检测限及耐用性均符合规定，易操作，准确度高；使用经方法学验证的检测方法，对采自云南东川、会泽、丽江的不同批次药材进行了甲素含量测定，数据结果表明，不同产地不同批次药材中的雪上一枝蒿甲素含量存在一定差异；考察了蒸、煮、高压炮制后不同温度干燥的雪上一枝蒿甲素含量变化，数据结果表明，不同炮制方式雪上一枝蒿甲素无显著变化，说明雪上一枝蒿甲素不易受炮制工艺影响，该结论与其化学性质相吻合(醇胺型二萜生物碱，无酯基，不易水解)。