两种花椒精油成分GC-MS分析及活性研究*

伍 燕，周中秋，汪 伟，易君明

(兴义民族师范学院生物与化学学院，贵州 兴义 562400)

花椒为芸香科花椒属植物[1]，果实成熟后在果皮部位富含的油腺可挥发出花椒特有的香味和麻味，花椒是调味料中不可或缺的香料，在我国种植面积较广，在西南地区产量和用量都较大，常用的有红花椒和青花椒[2-4]。红花椒(Zanthosylumbungeanum)果实成熟后表皮呈红色；青花椒(Zanthoxylumschinifolium)果实成熟后表皮呈绿色，二者在麻味和香味上有些区别。红花椒较香但烹调时间不宜过长，火候掌握不好会返苦；青花椒香味不如红花椒但麻味稍重且出油率高，因而炼制花椒油多选青花椒，二者结合使用恰当可使菜肴又香又麻[5-6]。花椒性温味麻，有芳香健胃、温中散寒、除湿止痛、杀虫解毒、止痒去腥的功效，是药食两用的香料植物[7]。

本研究用水蒸气蒸馏法提取本地产新鲜红花椒和青花椒精油，对其成分进行GC-MS分析并研究两种花椒的可挥发性成分；采用二倍稀释法比较两种花椒精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的抑菌活性；采用DPPH和ABTs自由基检测了两种花椒精油对体外自由基的清除效率，本研究为黔西南产红花椒和青花椒的进一步开发利用提供了参考。

1 实 验

1.1 材料与试剂

试验材料：红花椒和青花椒新鲜果实，7月份购于兴义丰源市场。

实验菌株：大肠杆菌(Escherichiacoil，CICC-10899)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，CICC-10786)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，CICC-10002)酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae，CICC-1002)。

药品和试剂：ABTs、DPPH，麦克林试剂公司；氯化钡、浓硫酸、葡萄糖、甲醇、二甲基亚砜等，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器和设备

SW-CJ-1F超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；LDZX-50FB高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；DHP-500电热恒温培养箱，常州市凯航仪器有限公司；DHG-9246A精宏电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；TQ8040气相色谱-质谱联用仪，日本岛津仪器有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 花椒精油提取

按料液比1：4将500 g新鲜红花椒或青花椒果实放入圆底烧瓶中并加蒸馏水，加热产生蒸汽后计时1 h提取挥发油，收集精油用干燥NaCl分层去水，4 ℃保存备用[8]。

1.3.2 花椒精油可挥发成分分析

色谱柱：DB-5 MS石英毛细管色谱柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)，载气为高纯氦气，流速为1.0 mL/min，分流比150：1进样量1 μL，进样口温度250 ℃，程序升温起始温度60 ℃，保持1 min，以1.5 ℃/min的速率升至100 ℃，再以5 ℃/min升温到250 ℃，保持5 min。

质谱条件：电子轰击(EI)能量70 eV，离子源温度200 ℃，传输线温度250 ℃，质量扫描范围为30～550 m/z[9]。

1.3.3 抑菌活性的测定

将精油用DMSO溶解配制成浓度为10000 μg/mL母液；将液体培养的各菌株与麦氏比浊液比对后调整菌液浓度到1×105cfu。

采用二倍稀释法测定花椒精油的最低抑菌浓度(MIC)，将96孔板的A1～A11孔列为实验组，A12孔为对照孔，重复三次。细菌用牛肉膏蛋白胨培养基(LA)，真菌用马铃薯葡萄糖培养基(PDA)，第1孔和第2孔各加100 μL的上述花椒精油母液，第2～12孔各加100 μL培养基，依次对2～11孔做对倍稀释；稀释完后分别在1～12孔中加入100 μL浓度为1×105cfu菌液。加完菌液的96孔板置于30 ℃恒温培养箱中静置24 h。实验结束后比较实验组与空白对照组混浊度差异，无细菌生长、培养基澄清且无沉淀的孔板内所含精油浓度即为最小抑菌浓度(MIC值)[10]。

1.3.4 花椒精油抗氧化活性的测定

(1)花椒精油工作液配制。称取适量红花椒和青花椒精油，用无水乙醇定容成100 mg/mL母液，依次稀释成80 mg/mL、60 mg/mL、40 mg/mL、20 mg/mL和10 mg/mL不同浓度工作液。

(2)ABTs·清除试验[11]。取96孔板，按照1:3的比例依次加入不同浓度花椒精油50 μL和ABTs工作液150 μL，混匀后避光静置6 min，在酶标仪上用734 nm波长测定样品吸光度值(Ai)；取不同浓度精油50 μL，加150 μL ddH2O，相同波长测定样品本底吸光度值(Aj)；50 μL的ddH2O加入150 μL的ABTs溶液，相同波长测定阴性对照吸光度值(A0)，每个浓度重复3次。

ABTs自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(3)DPPH·清除试验[12]。取96孔板，各浓度花椒精油和0.1 mmol/L DPPH工作液各加100 μL后混匀、避光静置30 min，调整酶标仪吸光度值在517 nm波长处测定，记录样品吸光度值(Ai)；不同浓度样液100 μL和无水乙醇100 μL混合后同法测定吸光度，记为样品本底吸光度值(Aj)；无水乙醇 100 μL和DPPH工作液100 μL混合后测定吸光度，记为阴性对照值(A0)。

DPPH清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

1.3.5 数据处理

用ORINIG 9.01、EXCEL 2010处理数据。

2 结果与讨论

2.1 红花椒和青花椒精油的主要成分

图1和图2分别为红花椒和青花椒精油可挥发性成分总离子流程图，各组分质谱碎片在质谱检索标准库NIST 14中进行匹配解析，匹配度达85%以上的红花椒有63个成分，占挥发性组分的94.35%，青花椒有43个成分，占挥发性组分的99.66%。按峰面积归一化法计算各成分的相对质量分数，结果如表1所示。

图1 红花椒精油挥发油的总离子流图

图2 青花椒精油挥发油的总离子流图

表1 红花椒和青花椒精油化学成分

续表1

续表1

2.2 花椒精油对各供试菌株的抑制活性

花椒精油对不同病原菌的最小抑菌浓度见表2、表3，青花椒精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果和红花椒精油无差别，对枯草芽孢杆菌、酿酒酵母的抑制效果比红花椒精油表现良好其最小抑菌浓度(MIC)分别为2500 μg/mL和1250 μg/mL。

表2 青花椒精油抑菌实验结果

表3 红花椒精油抑菌实验结果

2.3 花椒精油的抗氧化活性

如图3所示，对ABTs和DPPH自由基的清除效果，红花椒精油比青花椒表现好，经各自回归方程计算，红花椒对ABTs和DPPH自由基的清除率EC50值分别为0.50和14.29 mg/mL，青花椒对ABTs和DPPH自由基的清除率EC50值分别为68.43和88.98 mg/mL，清除效果相差较大。

图3 香樟精油对ABTs和DPPH的清除率

3 结 论

蒸馏法提取两种新鲜花椒精油的红花椒出油率为0.74%，青花椒为2.22%，青花椒的出油率是红花椒的3倍；经GC-MS鉴定，红花椒的成分是63种，青花椒是43种。红花椒的主要成分是2,7-二甲基-3-辛烯-5-炔(25.88%)、1,5-二甲基-1,6-环辛二烯(24.03%)、7-(甲基乙亚基)-双环庚烷(13.12%)、4-萜烯醇(7.16%)和芳樟醇(3.16%)；青花椒的主要成分是二氢卡维醇(39.26%)、金刚烷(23.23%)、2,7-二甲基-3-辛烯-5-炔(18.69%)、α-小茴香烯(8.43%)和罗勒烯(2.37%)，其中2,7-二甲基-3-辛烯-5-炔是二者共有成分，其它主要成分在含量和种类上区别很大，这是二者呈现出不同香味的原因。青花椒对枯草芽孢杆菌和酵母菌的抑菌效果比红花椒的好，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果二者区别不大，这是中医用花椒外用治疗真菌类感染妇科疾病的可靠证据；红花椒的抗氧化活性比青花椒强，这为红花椒的抗氧化活性开发利用提供了理论支持。