药用枇杷叶黄酮的制备工艺及分析方法研究

张培培，程爱民，王 超，周 浩

(扬州市职业大学，江苏 扬州 225007)

2020年初的新冠肺炎疫情突如其来，给中国乃至世界带来了影响。随着人们对于新冠肺炎的了解加深，治疗方案也呈现出多元化趋势。目前已有案例表明，中药对于轻症患者有明显的改善功效，可有效阻止患者的病情向重症方向发展。中药的应用存在两个方面的问题，其一，其有效成分是否具有明显的抗病毒和护肺功效。抗病毒功效的体现可以从提高免疫力的角度出发，而“护肺”功效则是阻止病情恶化的关键一环；其二，有效成分在患者口服后能否直接到达病灶部位，血药浓度是否达标，能否有针对性地解决局部组织或器官的问题。枇杷叶为蔷薇科植物枇杷的叶子。又名巴叶、芦桔叶。枇杷叶中含有挥发油、三萜酸类、黄酮类、皂苷类、有机酸类等多种化学成分，有效成分主要为黄酮类化合物和多糖类物质，因此具有抗炎止咳、保护肺脏，降血糖、抗病毒、抗衰老和抗肿瘤等药理活性[1-2]。选用枇杷叶提取物及卵磷脂脂质体的形式来制备缓释片剂，可有效解决上述的两个方面的问题。本文是基于上述课题的部分内容开展的相关实验结果。

目前，枇杷叶中黄酮类化合物的提取方法主要包括：溶剂浸取法、微波提取法、pH梯度萃取法、柱色谱法、HPLC色谱法等等。其中溶剂法的关键在于溶剂的选择，溶剂选取的主要依据有两个，其一为黄酮类成分的存在状态(游离、苷)及溶解性；其二为溶剂的溶解性能。考虑到乙醇的溶解范围较广且毒性小，枇杷叶中的多糖苷类物质易溶于水，因此多选用乙醇-水作为溶剂。黄酮类化合物的分析方法中常见的显色反应包括：盐酸-镁粉反应、 四氢硼钠还原反应、钠汞齐反应等；定量的分析多是通过紫外分光光度法或者高效液相色谱法来实现。

陈荣祥等[3]建立了加速溶剂萃取-超高效液相色谱法测定枇杷叶中齐墩果酸、熊果酸2种主要成分含量的方法。提取方法包括加速溶剂萃取法与超声提取法。其中加速溶剂萃取法具有简单快速、准确稳定、重复性好的特点，可用于枇杷叶中齐墩果酸、熊果酸的含量测定。

吴中含等[4]为了研究枇杷叶紫珠Callicarpa kochiana的化学成分及其细胞毒活性和抗炎活性，选用丙酮提取和硅胶柱层析相结合的分离方法进行分离纯化，再根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。结果表明，首次从该植物中分离得到5 个化合物：3,7,3',4'-tetramethyl-quercetin (1)、pachypodol (2)、14α-hydroxyisopimaric acid(3)、14α-hydroxy-7,15-isopimaradien-18-oic acid(4)、(16R)-16,17-dihydroxyphyllolladan-3-one (5)，其中化合物4具有细胞毒活性和抗炎活性。

傅贤明等[5]为开发利用枇杷叶植物资源，采用超声波法从莆田枇杷叶中提取总黄酮，通过单因素实验确定了影响总黄酮提取的主要因素及较优水平，然后利用正交实验法确定了最佳提取工艺，并初步探讨了枇杷叶黄酮提取物对酪氨酸酶活性的影响。

廖圆圆等[6]用乙醇浸提法提取枇杷叶总黄酮，提取量的测定选用称重法。评价总黄酮的抗氧化能力采用羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基清除体系，以还原力值为指标研究总黄酮提取物的抗氧化效应(维生素C为阳性对照)。结果表明，在一定的浓度范围内，枇杷叶总黄酮的抗氧化能力随质量浓度的增加而增强。研究结果还表明，枇杷叶总黄酮具有良好的体外抗氧化活性，能够很好地清除自由基，而且清除自由基能力与浓度存在量效关系。

鉴于枇杷叶具有多种挥发油成分，多种黄酮类化合物或其他生物活性物质，有良好的抗炎，抗氧化，防衰老，抗病毒，消炎等功效[7-8]，本研究以枇杷叶为原料，对黄酮类化合物提取工艺进行研究，配合缓释技术，着重对其分析方法进行研究，可有效解决中药应用中的问题。该研究的主要优势体现在：(1)具有抗炎保肝、治疗肿瘤的功效，复配一些生物活性物质可达到药效相互增益的效果。 (2)在枇杷叶有效成分的提取工艺上，采用溶剂提取法，与传统的水提法不同，与现有的溶剂提取法工艺也不相同，新工艺对脂溶性的具有抗炎保肝功效的黄酮化合物的提取效果好。 (3)研究的后期可对复配的处方进行研究，开发出新的复配处方。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪 器

AB204S电子分析天平，深圳市三利化学品有限公司；KQ-500型超声清洗机，昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪，上海天凡药机厂；D2F-6020型真空干燥箱，上海三发科学仪器有限公司；紫外分光光度仪，青岛聚创环保集团有限公司；Waters高效液相色谱仪，北京京科瑞达科技有限公司。

1.1.2 材料与试剂

枇杷叶提取物，自制；芦丁对照品(批号：100080-200707)，中国药品生物制品检定所；药用乙醇(批号：20170805)，安徽安特生物化学有限公司。

1.2 实验条件

高效液相色谱条件：Agilent 1220高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；

色谱柱：shin-packVP-ODSC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；

流动相：甲醇-水(60：40，V/V)；

流速：0.80 mL·min-1；

柱温：25 ℃；

检测波长：300 nm。

1.3 工艺路线

枇杷叶提取物的制备工艺：

选料-清洗-烘干-粉碎-浸提(超声波提取)-抽滤-减压蒸馏-收集馏分(产品1)-脱色干燥-制粉得到枇杷叶提取物A

在实际的研究工作中，我们针对三个重要的影响因素开展了单因素实验，包括：浸提液的组成、微波作用温度以及固液比等因素。单因素的实验结果如下：

图1选用的固液比为1：20，微波作用的时间为30 min，温度为70 ℃。由实验结果可知，最佳的浸提液的组成为70%(V/V)的乙醇水溶液。

图2选用的固液比为1：20，微波作用的时间为40 min，浸提液的组成为70%(V/V)的乙醇水溶液。由图2可知，最佳的微波提取温度为70 ℃。

图3微波作用的时间为40 min，温度为70 ℃，浸提液的组成为70%(V/V)的乙醇水溶液。由于实验过程中溶剂用量不同，因此需要将产品定容后再比较其纯度大小。由图3可知，最佳的固液比为1：30。

图1 浸提液的组成单因素实验

图2 微波作用温度单因素实验

图3 固液比单因素实验

2 枇杷叶中黄酮类化合物分析方法的建立

2.1 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品100 mg至250 mL量瓶中，加少量70%乙醇溶解后，加纯化水至刻度，取1 mL定容至100 mL容量瓶中，作为对照品溶液备用(0.004 mg/mL)。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取按1.3工艺制备的枇杷叶提取物A 30.0 mg，至250 mL量瓶中，用纯化水溶解并定容后，取1 mL定容至100 mL容量瓶中，作为供试品溶液备用。

2.3 准确度与精密度试验

取芦丁对照品溶液，0.032 mg/mL、0.04 mg/mL、0.048 mg/mL(分别相当于含量测定的80%、100%、120%)各三份，滤膜过滤后，取续滤液作为供试品溶液，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，根据峰面积，利用外标法，计算各样品的含量，根据加入量计算回收率和重复性。另由不同人员不同时间用不同仪器同法测定，计算中间精密度。回收率为100.3%，RSD均小于0.8%,结果见表1。

表1 回收率实验结果

2.4 耐用性试验

芦丁的主峰与其他主要降解产物峰基线分离；另取芦丁溶液0.01 mg/mL，在不同色谱条件下测定，芦丁含量测定结果一致。取同一供试液，在不同时间(1、2、4、8) h测定，溶液稳定,结果见表2。

表2 耐用性实验结果

2.5 产品的纯度与含量

利用高效液相色谱法进行定量分析，选用外标法进行含量测定，含量(CX)的计算公式为：

图4 产品1的高效液相色谱图

图5 标准品的高效液相色谱图

分析检测结果表明，产品1的峰面积为2148142，标准品的峰面积为3417344，经过计算可得芦丁的纯度为62.86%，含量为0.025 mg/mL。以上结果表明，与同类研究相比，制备工艺简单易行，且产品纯度高，工艺步骤少，适合工业化生产。产品的后期精制过程可选用聚酰胺柱色谱法、硅胶柱层析方法或者pH梯度萃取法以及结晶与重结晶的方法等等。

3 结 论

微波醇提的工艺可有效获得黄酮类化合物产品，产品纯度高达62.86%。利用HPLC-UV分析的固定相选用shin-packVP-ODSC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相选用甲醇-水(60：40， V/V)。分析方法的回收率在100.3%，吸光度的RSD 均小于0.8%，其分析方法的准确度和精密度都较好，完全达到对样品的测试需要。