高活菌数干酪乳杆菌LZ183E冻干保护剂的制备

周佳豪，雷文平，刘成国,周辉,周杏荣,叶望娟

(湖南农业大学 食品科学技术学院，湖南 长沙，410128)

随着对乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)益生功能研究的深入，其受到了食品和医药领域的广泛关注；为了让益生菌便于保存、运输及使用，对菌株的保护并制备成相应菌剂也成为领域的研究重点[1]。菌株菌液的干燥工艺是制备益生菌菌剂的关键步骤之一，目前，主要的干燥方式包括真空干燥、真空冷冻干燥和喷雾干燥等，大量研究表明，真空冷冻干燥是目前在保护LAB活力最为有效且应用最广泛的干燥方式，其是快速将菌液温度降低至冰点以下，变成固态，在高真空度和低温状态下固态菌液升华除水的一种干燥方式[2-3]。谢桂勉[4]比较了离心喷雾干燥和冷冻干燥对酸奶中LAB活性的影响，结果表明LAB的存活率分别为17.1%和53.5%，冷冻干燥对LAB的活力影响较小。并且WANG等[5]研究发现，与真空和热风干燥相比，真空冷冻干燥能够显著维持LAB发酵产物的抗氧化活性。

真空冷冻过程中LAB细胞内容物易发生变性导致菌株死亡，这就需要加入适宜的保护剂降低菌株在此过程中的死亡[6]。目前，常用的保护剂包括糖类(海藻糖、低聚木糖等)、蛋白质(脱脂乳粉、乳清蛋白等)以及其他聚合物(谷氨酸钠、抗坏血酸)[7]。不同类型的保护剂的作用机制存在较大，如低聚糖可以进入LAB细胞壁并被截留在细胞膜外而起保护作用；蛋白质可以在菌体表面形成蛋白膜，使得菌株免受外界环境的破坏而发挥保护作用；抗氧化剂能够降低菌株表面的氧化还原电位，减小益生菌的氧化损伤[8]。因此，复配使用不同类型保护剂可有效减小LAB在冷冻过程中的死亡。

本研究在高密度培养的基础上，通过单因素试验考察不同类型冻干保护剂(海藻糖、脱脂乳、低聚木糖和谷氨酸钠)用量对LactobacilluscaseiLZ183E在冷冻过程中存活率的影响；进一步通过响应面法，对保护剂进行复配研究，协调不同保护剂的性能而获得较高活菌数的干酪乳杆菌菌剂。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L.caseiLZ183E，湖南农业大学食品科学技术学院功能乳制品实验室；MRS肉汤、琼脂，广东环凯微生物科技有限公司；海藻糖、低聚木糖、谷氨酸钠，上海瑞永生物科技有限公司；脱脂乳粉，皇氏集团湖南优氏乳业有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2104型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；GZ-400-S型恒温培养箱，韶关市广智科技设备有限公司；SW-CJ-2D型双人单面垂直净化工作台，苏州净化有限公司；BKQ-B50II型全自动高压蒸汽灭菌锅，山东博科科学仪器有限公司；TG16-WS型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；LGJ-18C型台式高速离心机，北京四环科学仪器厂有限公司；MDF-86V408型医用-80 ℃低温保存箱，安徽中科都菱商用电器股份有限公司；Bante920型pH计，上海般特仪器制造有限公司。

1.3 试验设计

1.3.1 菌剂的制备

(1)菌株活化：将保存的LZ183E菌液在MRS液体培养基中37 ℃过夜活化3代。

(2)高密度培养：把活化后处于对数生长期的LZ183E以2%(体积分数)的接种量接种于优化后的MRS培养基中，37 ℃高密度培养30 h，获得菌液备用。

(3)菌泥的制备：在无菌的条件下，取2 mL菌液于10 mL无菌离心管中，8 000 r/min、4 ℃离心3 min，然后用灭菌生理盐水进行2次清洗，得到菌泥，备用[9]。

(4)冻干：向含菌泥的10 mL离心管中加入2 mL已配制的冻干保护液，于-80 ℃冰箱中冻存6 h，然后迅速放入真空冷冻干燥机中干燥24 h以上，直至菌液冻干呈显棉絮状，得到冻干菌剂，此过程保持无菌[10]。

1.3.2 单一组分的冻干保护剂用量的确定

通过单因素试验考察海藻糖、脱脂乳粉、低聚木糖和谷氨酸钠等保护剂的用量对LZ183E在冷冻过程中存活率的影响，其实验设计如下[11-13]：

按照1.3.1的方法制备冻干菌剂，其中控制真空冷冻干燥机条件不变，以菌株存活率和菌剂产酸能力为指标，探究不同质量分数的海藻糖(2%、4%、6%、8%、10%)、低聚木糖(2%、4%、6%、8%和10%)、脱脂乳粉(2%、6%、10%、14%和18%)、谷氨酸钠(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%)对菌株LZ183E在冻干以后活力的影响，确定其适宜的浓度范围，并以未加保护剂为空白对照组(CK组)。

1.3.3 复配保护剂的响应面法优化

在单因素试验的基础上，以菌株存活率为指标，选取对菌株活性影响显著的3个因素进行3因素3水平的响应面试验进行复配优化，确定保护剂的最佳配比。

1.4 测定方法

1.4.1 活菌数测定及存活率的计算

活菌数参照GB 4789.35—2016进行测定。将冻干菌粉按原比例复溶进行试验，冻干前后菌株存活率按公式(1)计算：

(1)

1.4.2 pH值的测定

将冻干后的菌剂以3%的接种量加入灭菌后的脱脂牛奶中，37 ℃发酵12 h后使用pH计直接测定发酵乳的pH值。

1.5 数据分析

利用Excel 2010软件进行数据整理及统计分析，以SPSS Statistics 21进行方差分析(ANOVA)、LSD多重比较以及进行正交试验方差分析，显著水平P<0.05；采用Design-Expert V 10 软件进行响应面分析；使用Origin 2018软件绘图。

2 结果与分析

2.1 海藻糖用量对菌剂活力的影响

海藻糖能够避免低温和失水等极端环境对益生菌造成损伤，其使得液晶-凝胶态相变温度降低，保持菌体细胞膜处于液晶状态，减缓相变引起的细胞膜磷脂膜结构和功能损伤[14]。由图1可知，虽然海藻糖用量在2%～10%(质量分数)时对LZ183E在冻干过程的保护作用无显著差异(P>0.05)，菌株存活率处于波动状态，但是冻干后菌株LZ183E仍然维持较高活力，其存活率在(93.479±1.667)%～(97.326±0.25)%，显著高于CK组(P<0.05)。当海藻糖用量在6%(质量分数)时，对菌株的保护效果最好，并且此时菌剂的产酸能力也对应较强，发酵12 h后发酵乳的pH相对较低，为4.572±0.002；SKIBINSKY等[15]研究发现使用不同量的海藻糖，单层和双层的模拟磷酸分子膜面积均发生扩张，但仅是有或无海藻糖两种情况的数据差异，不存在海藻糖用量依赖性，这也就证明不同用量的海藻糖对菌株存活率影响较小的现象。总体而言，海藻糖是一种较佳的保护剂，并且在6%(质量分数)的用量时对菌株的保护作用较好。

图1 海藻糖用量对菌剂活力的影响Fig.1 Effect of the trehalose on the viability of LAB agents注:不同小写字母代表差异显著(P<0.05)(下同)

2.2 低聚木糖用量对菌剂活力的影响

低聚木糖是应用较为广泛的功能性低聚糖，其可作为益菌因子在菌剂制备中发挥双重作用，不仅能有效保护益生菌在冷冻过程中的活力，还能促进益生菌的生长代谢[16]。由图2可知，随着低聚木糖用量的增加，LZ183E在冻干后的存活率表现出先上升后下降的趋势，在10%(质量分数)的添加量时具有最高存活率(96.081±0.395)%，明显高于CK组；尤其当用量从2%升至6%(质量分数)时，菌株存活率显著升高(P<0.05)，而此后随着用量进一步增大，其存活率的增加或降低并不显著(P>0.05)，表明低聚木糖在低浓度时其保护效果具有浓度差异性，而当过高时已经饱和对菌株的保护效果不明显。此外，菌剂在产酸能力上，随着低聚木糖用量的升高也表现出较强的产酸能力，发酵12 h后发酵乳pH可降低至4.5以下，这进一步表明低聚木糖可作为益生因子而促进LAB的生长代谢。综合可得，当低聚木糖添加量为10%(质量分数)时有较好保护作用。

图2 低聚木糖用量对菌剂活力的影响Fig.2 Effect of the xylooligosaccharides on the viability of LAB agents

2.3 脱脂乳粉用量对菌剂活力的影响

脱脂乳粉是一种复合保护剂，包含丰富的蛋白质(乳清蛋白和酪蛋白)、糖类等物质，不仅是益生菌优良的天然培养基，且对在保护益生菌方面具有重要意义[17]。由图3可知，脱脂乳粉的保护作用也存在用量依赖性，随脱脂乳粉用量的增加，LZ183E的存活率缓慢上升，在10%～14%(质量分数)趋于稳定，此时菌株存活率高于97%，而当高于14%的用量时存活率急剧下降(P<0.05)，但仍然高于CK组；并且菌剂的产酸能力也表现出对应关系，菌株存活率越高，产酸能力越强。这可能是由于脱脂乳粉是一种复合型保护剂，物质组成较为复杂，冻干后其无定型的多孔结构和蛋白保护膜，有效增强了菌株存活能力和菌剂的复水能力；然而脱脂乳粉用量过高，体系渗透压升高，使得菌株细胞结构被破坏，细胞内容物外泄和蛋白质变性等，存活率显著降低[18]。由此，选用10%(质量分数)的脱脂乳粉为最佳。

图3 脱脂乳粉用量对菌剂活力的影响Fig.3 Effect of the skimmed milk powder on the viability of LAB agents

2.4 谷氨酸钠用量对菌剂活力的影响

谷氨酸钠属于氨基酸类物质，分子质量小，可以透过益生菌细胞膜进入细胞内，抑制并减缓冰晶的生成和生长，从而避免冷冻给菌株造成的损伤[19]。由图4可知，谷氨酸钠用量在0.5%～1.5%(质量分数)时菌株保持着高于95%的存活率，当用量大于1.5%(质量分数)时干菌株存活率显著下降(P<0.05)，并且用量在2.5%(质量分数)时存活率最低，为(85.758±0.949)%，已经接近CK组，对菌株的保护作用表现出明显不足。此时产酸能力也相对较弱，但对整体产酸能力影响不大。这可能是由于谷氨酸钠能够透过细胞膜进入干酪乳杆菌细胞内，当谷氨酸钠质量分数过高，进入胞内的谷氨酸钠含量也偏高，导致胞内部分活性物质失活，而当菌株在低温和失水状态时难以较好地维持其生命活力，其存活率显著降低。因此，选择1.5%(质量分数)的谷氨酸钠用量最为适宜。

图4 谷氨酸钠用量对菌剂活力的影响Fig.4 Effect of the sodium glutamate on the viability of LAB agents

2.5 复配保护剂的响应面分析法优化结果

通过分析单因素试验结果，控制海藻糖用量为6%，以L.caseiLZ183E存活率为指标，进一步对低聚木糖、脱脂乳粉以及谷氨酸钠复配用量进行优化；其Box-Behnken 设计表及结果分别见表1和表2[20-21]。

表1 保护剂复配优化Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for compounding of protective agents

表2 Box-Behnken试验结果与分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken tests

软件Design Expert V 10对试验结果拟合的回归方程为Y=98.226 8+0.551 25X1-0.320 125X2-0.350 875X3-1.063X1X2-0.134 5X1X3-0.057 75X2X3-1.346 275X12-1.087 025X22-0.207 525X32。其方差分析结果如表3所示。

表3 响应面结果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

由表3可知，本实验建立的模型极显著(P<0.01)；失拟项不显著(P>0.05)，因此模型可靠性较高；并且R2=0.912 5，说明脱脂乳粉、低聚木糖和谷氨酸钠对LZ183E存活率的影响显著；信噪比(signal-to-noise，S/N)=8.728 4>4，也从另一角度说明所建立的模型是可靠的。经方差分析，3个因素对凝固型发酵牛乳影响的主次顺序为X1>X3>X2，即脱脂乳粉用量>谷氨酸钠用量>低聚木糖用量。

研究表明,响应面的等高线越偏向椭圆，因素间交互作用越强；并且其呈现在闭合的椭圆或圆形，表明在试验范围内有最值[22-23]。试验所得响应面曲线及等高线如图5所示。当谷氨酸钠用量保持不变时，随着脱脂乳粉和低聚木糖用量的升高，菌株存活率均表现为先升后降，脱脂乳粉用量在8.5%～13.5%(质量分数)和低聚木糖量在6%～10.5%(质量分数)较为适宜；等高线呈现闭合椭圆且响应面为凸形，表明脱脂乳粉用量和低聚木糖用量交互作用显著，并且此区间内有最大值。当低聚木糖用量不变时，随着脱脂乳粉和谷氨酸钠用量的增大，菌株存活率也表现出先增后降的趋势，脱脂乳粉用量在8.7%～13.2%(质量分数)和谷氨酸钠用量在0.3%～1.75%(质量分数)较佳；此范围内等高线为闭合椭圆且响应面为凸形，说明脱脂乳粉用量和谷氨酸钠用量交互作用有最大值。当脱脂乳粉用量不变时，随低聚木糖和谷氨酸钠用量的增加，菌株存活率同样表现为先增后降的趋势，低聚木糖用量在7.1%～11.9%(质量分数)，谷氨酸钠用量在0.4%～18%(质量分数)较佳；此时等高线的形状为闭合椭圆且响应面为凸形，说明在此区间内低聚木糖和谷氨酸钠交互作用强，并具有最大值。此外，上述分析和表3中的显著性一致。

a-X1、X2交互作用；b-X1、X3交互作用；c-X2、X3交互作用图5 各因素交互作用的响应面和等高线Fig.5 Response surface and contour of the interaction of various factors

3 结论

利用Design Expert 8.0.5软件将结果带入模型进行统计分析，确定保护剂的最佳复配参数为低聚木糖用量8.785 55%、脱脂乳粉用量11.484 2%和谷氨酸钠用量1.038 34%(均为质量分数)，此时菌株存活率预测值为98.539 7%。为了提高实际操作效率，并结合单因素实验结果，最终将配方修订为海藻糖用量6.0%、低聚木糖用量8.5%、脱脂乳粉用量11.5%和谷氨酸钠用量1.0%(均为质量分数)。在此最优配比下进行验证试验，菌株的存活率为(98.236±0.137)%，接近模型的预测值，表明了此模型的可靠性，获得了较高活菌数下高存活率的L.caseiLZ183E菌剂。