食管鳞状细胞癌类器官的应用

刘卓健， 周 博， 段芳龄

郑州大学第二附属医院 郑州大学消化疾病研究所，河南 郑州 450014

食管癌是一种高度恶性的肿瘤，在我国，尤其是河南、河北、广东以及江苏等省份，发病率明显较高。据2019年中国肿瘤登记年报统计，全国食管癌的发病率和死亡率分别排在第6位和第4位。在我国食管癌的组织类型以食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma， ESCC)为主，多数患者就诊时已经处于中晚期，预后较差且疗效存在明显的个体差异。因此，深入了解ESCC的发病机制，为ESCC患者提供精准诊疗，仍是临床治疗工作的重中之重。

类器官是利用体外3D细胞培养技术在三维环境中培养后得到的多细胞团，具有近似源器官的结构和功能[1]。肿瘤类器官主要来自胚胎干细胞和诱导性多能干细胞，利用细胞因子来引导细胞分裂和定向分化。细胞因子和细胞外基质组成干细胞培养微环境，是类器官更新和分化的物质基础。通过人为调控培养系统的成分，由细胞自主的分化为特定结构，完成类器官自组装过程。该培养方法不仅能够实现体外长时间增殖，还具有多次传代后仍能保持基因组特征和异质性稳定等优点。因此，类器官技术在构建疾病模型、肿瘤的发生发展和转移机制研究、药物筛选和个体化治疗研究、干细胞研究等方面具有广阔的应用前景。

目前为止，人类已经在一系列恶性肿瘤中发现了肿瘤干细胞，继而成功建立人前列腺癌、胃癌、胰腺导管癌、结直肠癌、肝细胞癌、子宫内膜癌、乳腺癌等肿瘤类器官的培养方法[2]。由于ESCC干细胞缺乏特异性的表面标志物，导致有关ESCC类器官的研究才刚刚起步。直到2018年，Kijima等[3]才从ESCC患者组织中定向诱导并鉴定成功为ESCC类器官。本文就ESCC类器官技术的构建和应用作一概述。

1 ESCC类器官技术的成功构建

早在2009年，Hans Clevers和其实验室的博士后Sato用来源于小鼠肠道的成体干细胞培育出首个肠道类器官，随后基于这种肠道干细胞建立起一种新的体外培养方式[4]，即小肠类器官培养，通过在基质胶中加入特殊的生长因子，模拟体内环境，最终形成具有肠上皮各种类型细胞及肠腔形态的类器官，既保留了肠上皮细胞原始分化的能力，又能对其进行长期体外培养。这是干细胞及类器官领域的一大技术进步，是一个里程碑事件。

采用三维培养系统，以基底膜提取物(basement membrane extract，BME)作为细胞外基质，加入Wnt3a、R-spondin-1、Noggin、EGF、FGF10、SB202190、A83-01、B27、烟酰胺等因子进行培养，构建食管腺癌类器官。从患者活检组织中，Kijima已成功建立ESCC类器官的方法[3]。他们用组织消化液对ESCC活检组织进行消化，37 ℃，45 min孵育。每毫升组织消化液中主要包括6.25 mg/ml中性蛋白酶Ⅰ(Dispase Ⅰ)，5 mg/ml胶原酶(Collagenase)，10 mmol/L ROCK 抑制剂和0.5 mg/ml两性霉素B(fungizone)。孵育后重悬细胞并离心，再用质量浓度为2.5 g/L胰酶(含EDTA)消化液孵育(37 ℃，10 min)后，用含250 mg/L大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean trypsin inhibitor)的PBS溶液中和胰酶消化。细胞悬液用70 μm细胞筛进行过滤后，用DMEM/F12完全培养基进行培养。DMEM/F12完全培养基中主要包含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，HEPES。细胞计数后，用50 μl Matrigel包含2×104个细胞均匀铺在24孔细胞培养板板内底部，待凝固后，再添加500 μl类器官培养基。类器官培养基主要包含DMEM/F12基础培养基，1×N2，1×B27，0.1 mmol/L N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)，50 ng/ml重组人EGF，2% Noggin/R-Spondin-1，100 ng/ml重组人Wnt3a，500 nmol/L A83-01，10 nmol/L SB202190，10 nmol/L 胃泌素(Gastrin)、10 nmol/L 烟酰胺(Nicotinamide)和10 mmol/L Y27632。常规培养条件培养10～14 d，期间需用倒置相差显微镜定时观察细胞状态、数量和直径；用台盼蓝染色以确定细胞活力；用含有Dispase Ⅰ的Matrigel将细胞球消化，固定后进行组织学检查鉴定，观察第14天50 mm的细胞球的总量。

2 ESCC类器官的应用

类器官不仅是研究组织及肿瘤发生、发展机制的有效工具，还能用于药物疗效和药物毒理学性质的检测，有助于发展药敏检测和个体化治疗，具有广阔的应用前景。随着食管腺癌类器官的深入研究，对其概述形态学、基因组学和原发性肿瘤的转录图谱包括驱动基因、点突变、拷贝数、变异序列和方式以及核型分析已经证实反映原发性肿瘤克隆结构的多克隆性有了更加清晰的认知。

2.1 正常组织的鳞状上皮异型分化的研究肿瘤从发生、发展到恶化、转移及药物抵抗是一个多因素、多阶段、多步骤和多环节相互联系的渐进过程，而利用类器官技术建立不同演变阶段的肿瘤模型，可以为各阶段机制研究工作提供可用的优质平台。

对于正常上皮组织而言，上皮细胞呈现出明显的极性，即细胞的两端在结构和功能上具有明显的差别。细胞极性是在多细胞生物中广泛存在的重要特征之一，通常可以通过细胞形态即可辨别。上皮细胞的一面朝向身体表面或有腔器官的腔面，称顶端(游离面)；与顶端相对的另一面朝向深部的结缔组织，称基底端(基底面)。上皮细胞的顶端和基底端的形态和结构的差别保证了充分发挥其外分泌、吸收、屏障等生理功能。同时，细胞极性的形成是在诱导剂刺激下，由细胞骨架、紧密连接、桥粒等介导并重新排列，最终导致细胞内部的亚细胞结构或分子呈不对称分布。食管腺癌类器官模型让研究者们发现了细胞极性中断现象[5]。

以食管腺癌类器官构建为例，细胞来源于食管腺癌患者的手术切除标本。食管黏膜上皮为未角化复层扁平鳞状上皮，其中基底层由具有增生能力的处于不同分化阶段的未成熟细胞组成，各细胞层之间形成分化梯度[6]。正常食管黏膜依靠表层细胞的分化、基底细胞的分裂以及分化梯度之间相互平衡维持上皮细胞组织的稳态。但化学致癌物、辐射、酸、生长因子、炎性细胞等诸多因素均可以打破这一精细平衡，导致上皮细胞发生恶性分化，包括成熟细胞的反分化、未成熟细胞的异常分化和抑制正常细胞的分化。正常鳞状细胞分化异常是ESCC发生的重要机制之一[7]。鳞状上皮非典型增生为ESCC常见的组织学癌前病变，小鼠ESCC类器官模型与细胞谱系追踪技术相结合，表明ESCC的癌前细胞来源于基底角质层[8]；该模型与蛋白质分析技术相结合，能够确认影响癌前细胞与侵袭相关的表皮生长因子受体(EGFR)、转化生长因子β(TGFβ)和肝细胞生长因子(HGF)[9]。

2.2 干细胞相关研究类器官是指由具有干细胞潜能的细胞进行体外三维培养后形成的细胞团，该细胞团不仅能够进行长期传代培养，其具有自我更新和自我组装的能力，并表现出稳定的表型和遗传学特性，显示出与来源组织相似的结构和功能[1,10]。类器官培养依赖于胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。胚胎干细胞具有多胚层分化能力，体外培养时能够无限增殖和多向分化[11]；而诱导性多能干细胞在刺激物的诱导下，也具有多向分化能力。ESCC干细胞与ESCC早期复发有着密切的关联，这类细胞表面具有CD44高表达的特点[12]。因此，类器官可以作为食管与ESCC干细胞研究的重要平台，进而推动食管上皮干细胞增殖分化及ESCC发生、发展机制的研究。

2.3 类器官技术与其他新技术联合应用深入探索肿瘤发生机制目前，研究者们已经对食管腺癌类器官进行全基因组测序和分析、染色体多重核型分析、RNA序列测序等工作，并对食管腺癌类器官的基因组信息、转录图谱、驱动基因序列和位置、点突变序列和位置、拷贝数改变和核型多克隆性等诸多方面进行了注释。表明类器官培养技术能为研究肿瘤发生机制方面提供丰富的数据和资源信息[5]。虽然目前对于ESCC类器官与测序技术联合使用鲜有报道。但对临床368例ESCC患者组织进行单细胞测序，通过对其基因特征和肿瘤相关信号途经分析，能够成功将癌细胞与其他异质性细胞区分[13]。未来，我们期待ESCC类器官能够与测序技术联合应用，为其发病机制探索提供更多的数据和信息。在ESCC的动物模型方面，已出现p27敲除小鼠[14]。研究者们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术已经成功构建了基因突变小鼠结肠癌类器官[15]，这种基于类器官培养技术和基因编辑技术联合使用可以用于小鼠类器官模型构建，期待这一技术在ESCC类器官培养中发挥作用。

2.4 ESCC高度异质性与个体化治疗ESCC的高度异质性不仅表现在不同患者之间，还表现在同一患者不同病灶之间，甚至同一病灶的不同时间。而ESCC类器官具有体外多次传代后基因组仍然保持稳定的明显优势，能够帮助我们更深入地了解其异质性。研究者们对ESCC临床样本进行基因组分析后显示，ESCC的异质性以瘤间和瘤内两种形式呈现，瘤间异质性指的是不同患者的肿瘤表型和分子差异，瘤内异质性是指同一肿瘤内的生物变异[16]。ESCC的异质性主要表现在基因组和表观基因组层面。基因组层面主要是体细胞突变、拷贝数改变、染色质重排等[17]；而表观基因组表现在微环境变化和修饰变化等方面[18]。Kijima等[3]成功从临床患者活检组织中构建了ESCC类器官的系统，然而，鉴于肿瘤微环境的重要性，对ESCC类器官系统仍需继续优化相关分化因子、基底细胞和免疫细胞等成分，才能够真实地再现ESCC整体的异质性[8]。

对于早中期ESCC患者来说，可以先接受新辅助放化疗，再评估是否接受手术治疗。与单独手术相比，新辅助放化疗确实能够提高患者的总体生存率。约有25%的患者对新辅助放化疗表现出敏感，但也有约20%的患者对新辅助放化疗不敏感。目前，胰腺癌类器官模型已经辅助临床患者制定个体化的治疗方案[19]。

Banki等[20]将10个食管腺癌患者来源的类器官对24种抗癌化合物的药物敏感性，与临床体内敏感性进行对比，结果显示一致。提示患者来源的肿瘤类器官具有一定的药物选择和疗效预测能力，有望利用该平台预测不同患者的药物反应并展开个体化治疗[5]。参考食管腺癌类器官的药物敏感性，ESCC类器官的高通量药敏实验也需要注意由于类器官与原发肿瘤生长的微环境存在客观差异可能导致对药物敏感性出现偏差以及治疗过程中产生的耐药性等问题，提示在ESCC类器官的培养系统方面仍有很大的优化空间。

2.5 类器官技术与循环肿瘤细胞联合应用提示临床病程发展循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是指因自发或诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的一类肿瘤细胞[21]。CTCs的绝对数量、数量变化、细胞表型、扩增能力、组学分析、药敏测试等参数，正与肿瘤早期发现、分级、癌症预后、治疗方案指导、药物反应监测等临床工作建立起愈来愈多的联系。但CTCs在外周血中存在的数量极少，捕获率较低；捕获后也存在小片段DNA干扰等诸多缺陷，限制了其在临床的广泛应用。目前，研究者们将前列腺患者外周血中的CTCs用类器官技术加以培养，已经成功建立了前列腺肿瘤类器官模型[22]，表明类器官技术不仅适用于细胞数量较大的样本，同样也适用于细胞数量稀少的CTCs。

研究者们对90例食管癌患者外周血中的CTCs进行动态监测及后期随访后发现，CTCs数量多的患者生存期明显短于CTCs数量少的患者[20]。这表明，CTCs能够作为食管癌患者术后的复查指标，其绝对数量的多少可在一定程度上提示病情的发展。CTCs成功用于前列腺肿瘤类器官的建立，提示其他肿瘤，包括ESCC，患者CTCs可作为类器官培养的细胞来源，为ESCC的早期诊断、疗效监测和评估及精准治疗方面带来更大的价值。

目前，食管癌方面，类器官培养技术以食管腺癌方面的研究较为全面和深入，包括组织病理学、基因组学、克隆动力学及中等通量药敏试验，这对于今后ESCC类器官的科学研究和临床治疗具有重要的参考价值。但以上工作在ESCC类器官方面尚处于起步阶段，仍有许多问题有待进一步探究，如：ESCC类器官的体外培养环境与肿瘤在体内的微环境差异；ESCC类器官培养系统中暂无涉及体内的免疫成分和血管成分，培养体系仍需进一步优化；对于ESCC患者手术切除组织培养的成功率还有待提高；利用ESCC类器官所进行的体外药敏试验结果仍需进一步与临床结合等。