乳酸链球菌素（Nisin）的特性及应用

李仲玄 程 强 姚蒙蒙 胡 聪 买尔哈巴·艾合买提 王晓冰 张日俊 斯大勇

（中国农业大学饲料生物技术实验室 动物营养学国家重点实验室，北京100193)

1 Nisin的概述

乳酸链球菌素——Nisin 从1980 年起被FDA 允许用作食品添加剂[1]。Nisin 最早发现于1928 年[2]，1947 年被命名为Nisin[3]，第一次商业化应用是在1957 年，由Aplin & Barrett 出品，其产品被命名为Nisaplin。目前，已经有超过60 个国家和地区批准Nisin 作为一种纯天然食品防腐剂和保鲜剂使用，被广泛用于乳制品、肉制品、罐装食品、酒精饮料、酱菜和巧克力中。Nisin 在1971 年由Gross 和Morrell 确定为含有34 个氨基酸的小分子肽，存在翻译后修饰，一般带有一个羊毛硫氨基酸，四个β-甲基羊毛硫氨基酸和一些不常见的氨基酸残基如脱氢丙氨酸和脱氢酪氨酸。Nisin 通常带有硫醚键形成的分子内环，这种环状结构，是其破坏细胞膜完整性的一个重要的性质，这种环状结构维持了肽的刚性，并保护它不受蛋白酶和热降解的影响[4-5]。Nisin 对部分革兰氏阳性菌如单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和藤黄微球菌(Micrococcus luteus)等具有较强的抑制作用，其本身是一种无臭无色无味的低毒物质[6-9]。一般认为Nisin 对芽孢的杀灭作用大于对营养型微生物的杀灭作用，这是由于它具有抑菌作用而非杀菌作用[10]。

Nisin有多种不同的类型，A、Z、F、Q和U型等，Nisin Z 和A 的区别在于第27 位的氨基酸由组氨酸变为天冬酰胺（His 27 Asn），Nisin P 由Streptococcus suis 和Streptococcus gallolyticus subsp. pasteurianus产生[11-12]。Nisin F，由南非淡水鲶鱼肠道分离的L. lactis F10 菌株的质粒编码，与Nisin A的不同在于第27和第30位氨基酸（His 27 Asn、Ile 30 Val）[13]。Nisin Q，从日本发现的L. lactis 61～14 中分离，与Nisin A 存在4 个氨基酸的差异，分别为His 27 Asn、Ile 30 Val、Ala 15 Val和Met 21 Leu[14]。Nisin U 和U2 从S. uberis 中分离得到。Nisin U 有9 个氨基酸与Nisin A 不同：Ile 4 Lys、Ala 15 Ile、Gly 18 Thr、Asn 20 Pro、Met 21 Leu、His 27 Gly、Ser 29 His、Ile 30 Phe 和His 31 Gly，并且缺少Nisin A C 端的三个氨基酸，除此之外Nisin U2 中还缺少了第一位的Ile[15]。Nisin D 是从人分离株唾液链球菌5M6c 中分离并鉴定的，与Nisin A 相比，Nisin D 的25 位氨基酸由甘氨酸取代（Thr 25 Gly）、28 位半胱氨酸被缬氨酸取代（Cys 28 Val）、29 位丝氨酸被组氨酸取代（Ser 29 His）[16]。上述不同类型的Nisin 中，Nisin A 是抑菌活性最高的一种，市面上常用的商品化Nisin—NisaplinTM是由2.5%的Nisin A、77.5%的NaCl 和脱脂奶粉(12%的蛋白质和6%的碳水化合物)组成[17]。

2 Nisin的作用机理

Nisin 与细菌细胞膜上的阴离子脂质相互作用，从而引起细胞膜的扰动达到抑制细菌的作用。由Nisin-阴离子脂质相互作用形成的孔道会导致三磷酸腺苷(ATP)、氨基酸或重要离子梯度的崩溃而导致细胞死亡[18-19]。通常认为Nisin 与细胞膜的相互作用是通过两种不同的机制发生的。第一种机制：在微摩尔浓度范围内,Nisin 与膜上阴离子脂质结合表现出低亲和力渗透(性)；第二种机制：在纳摩尔浓度范围内,Nisin 与细胞膜上lipid II 相互作用，形成由4 个lipid II 分子和8 个Nisin 分子组成的孔道[20-21]，造成细胞内物质泄漏。研究表明，lipid II 介导的孔隙复合物比没有lipid II 时形成的复合物更加稳定[21]。在抑制孢子的机制中，Nisin 与蛋白残基中的巯基结合，这与抑制细菌营养体作用机制不同,在加热时结合使用Nisin，能增强其抑制孢子的活性。因此，Nisin 可用于酸性食品和热处理食品的添加剂[22]。

3 Nisin的应用及研究进展

Nisin在食品行业中的应用历史悠久，早期主要应用于奶酪生产中，对Listeria monocytogenes 具有较强的抑制作用，与NaCl 混合使用或者在低pH值时均可增强其抑菌效果[23]。最近的研究表明Nisin A 能够延长Galotyri奶酪的保质期，在添加100 IU/g和200 IU/g的Nisin A时，奶酪的保质期为18～19 d，而对照组（不添加Nisin）的保质期则为14～15 d[24]。Nisin A 可有效抑制对高脂牛奶布丁中腐败产孢细菌、Bacillus 和Paenibacillus，延长高脂牛奶布丁的保质期[25]。在可生物降解聚合物羟丙基甲基纤维素、壳聚糖、酪蛋白酸钠和聚乳酸中加入Nisin，使材料缓慢释放Ni⁃sin，可长期维持材料的抗菌效果，可延长食品的货架期[26]。

当Nisin 在食品中使用时，它的活性受到许多因素的影响。Nisin 与食物基质成分结合或相互作用会降低Nisin 的作用效率，如Nisin 与牛奶成分的相互作用将导致其功效大量丧失[27]。此外，游离形式的Nisin易被酶降解而失效[28-29]。细菌细胞壁上的正电荷通过影响Nisin 与细菌表面的静电作用力从而影响Nisin的抑菌活性[30]。纳米材料的使用，可以有效控制Nisin的释放和传递，在一定程度上克服Nisin 应用中这些问题[31]。抗氧化剂、抗菌素和防腐剂等具有不同分子和物理结构的功能成分，通常被用作涂料或加入到某种形式的输送系统中。基于这一目的的纳米技术的传递系统已有报道，包括纳米脂质体、纳米乳液、纳米颗粒和纳米纤维等[32]。脂质体是一种很有前途的给药系统，因为它们体积小，具有疏水性、亲水性和生物相容性[33]，并且用于脂囊泡形成的磷脂是天然双分子层的主要成分[34]，脂质体的缺点包括储存时的不稳定性和对外界因素如pH值、温度和渗透压变化的高度敏感性。将Nisin 掺入脂质体的限制性因素是Nisin 会与脂质体膜相互作用，从而导致脂质体膜破裂[35]。另一个影响纳米脂质体应用的因素之一是制备工艺：加热法制备的纳米脂质体对细胞完全无毒，而传统的挥发性溶剂法制备的纳米脂质体则具有明显的细胞毒性[36]。使用超临界二氧化碳反溶剂沉淀技术制备的缓释Nisin和聚L-乳酸(L-lactide)的纳米胶囊，可在长达45 d 的时间中抑制乳酸菌Lactobacillus.delbrueckii的生长，而未被包被的Nisin，其效果则只能持续大约4 d[37]。尽管包被Nisin 具有较长的应用时长，但由于此法需要运用超临界二氧化碳，因此成本非常昂贵，如何在低成本的过程中建立Nisin 缓释和供应系统有待进一步的研究。用吐温20包被Nisin后在牛奶中有更好的抗李斯特菌活性，但由于蛋白质和聚合物的溶解度不同，在脂质体中使用有机溶剂系统进行Nisin 包被受到限制，这可能会影响蛋白质的亲水/疏水性从而引起蛋白质的改性[38]。Benech 等将氢化卵磷脂脂质体中包被Nisin Z 用于Cheddar cheese 中，在奶酪6个月的成熟期内，采用筛选平板检测法未检出L. innocua。检测不同前体脂质体，包括氢化磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、非特异性带电磷脂，大豆基不饱和磷脂等对Nisin Z 的包被效果，主要考察指标有脂肪酸组成、胆固醇含量和Nisin Z 的含量，结果表明氢化磷脂酰胆碱脂质体的包被效率最高，培养基pH 值和Nisin 浓度对Nisin 的包被效率均有较大影响[39]。pH 值从3.6升高到6.6会降低氢化脂质体的包被效率。此外，在奶酪中使用包被的Nisin 胶囊并未对发酵产生不利影响，并且包被胶囊在不同的温度循环下是稳定的[40]。Nisin Z 从脂质体中稳定释放的能力在牛奶中最高，其次是磷酸盐缓冲液、生理盐水和乳清[41]。将Nisini 脂质体作为添加剂的商业化使用，还需要进一步的研究来优化系统中的包被体系和被包被的Nisin的抗菌活性，以获得更有效的传递系统。

此外，Nisin 在口腔医学方面也具有较大的应用前景，以Nisin 为基础的漱口水在比格犬模型中进行了评估，结果显示该漱口水可以预防牙菌斑的形成和牙龈炎症[42]，其在预防龋齿和根管治疗方面也具有较好的效果，但在口腔医学方面的应用仍需要体内研究的支持[43]。

在畜牧方面，Nisin被用作预防牛乳腺炎的药物，通常在挤奶前和挤奶后的乳头浸渍产品中使用[44]。

4 总结

Nisin 在全球市场上有较大的商业机会，与纳米技术的结合有助于提高Nisin的使用效率。不同形式的纳米系统，如纳米脂质体、纳米颗粒、纳米纤维和纳米乳等与目标细胞都具有较强的相互作用，提高了效率，降低了使用Nisin的成本和数量，具有较大的应用前景。然而纳米技术在添加剂使用中的安全性有待进行进一步的研究。