dMMR/MSI-H型转移性结直肠癌患者免疫检查点抑制剂免疫耐药可能相关机制的研究进展

王康，贾军梅

1 山西医科大学第一临床医学院，太原030001；2 山西医科大学第一医院

结直肠癌(CRC)是我国癌症相关死亡的主要原因之一，病死率在男性中排第3位，女性中排第5位[1]。由于筛查率较低，85%以上的结直肠癌发现时即为中晚期，即使经过手术、放化疗、靶向治疗等综合治疗，患者5年生存率仍低于40%[2]。因此，开发更有效的治疗方法是亟待解决的问题。在过去的10年里，因免疫检查点抑制剂(ICIs)在黑色素瘤和肺癌中获得持久反应，引起了人们的高度关注。2017年，Pembrolizumab和Nivolumab两种抗程序性死亡受体1(PD-1)抗体相继被FDA批准用于治疗经治的DNA错配修复缺陷(dMMR)/微卫星高度不稳定(MSI-H)型转移性结直肠癌(mCRC)。同期研究显示，ICIs在DNA错配修复正常(pMMR)、微卫星稳定(MSS)或微卫星低度不稳定(MSI-L)的mCRC中无效。此外，ICIs在dMMR/MSI-H型mCRC中客观有效率只有30%～50%，且在疾病控制后，仍会出现疾病再次进展，即对ICIs存在耐药问题。为此，我们对mCRC患者使用ICIs治疗产生免疫耐药的可能相关机制综述如下。

1 dMMR/MSI-H型mCRC患者ICIs原发性耐药机制

dMMR/MSI-H型mCRC患者对ICIs产生原发性耐药的确切机制尚不清楚，可以通过6个方面来解释可能的相关机制。

1.1 免疫监视及免疫逃逸 Gryfe等[3]报道，与其他类型患者相比，dMMR/MSI-H型mCRC患者的淋巴结转移和远处转移较少。Buckowitz等[4]研究发现，在dMMR/MSI-H型mCRC患者中，肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)具有由离散的淋巴细胞聚集组成的克罗恩样淋巴反应，与较低的远处转移风险相关。这表明在肿瘤早期，dMMR/MSI-H型mCRC可能通过免疫监视作用，抑制肿瘤转移的发生。另一方面，当dMMR/MSI-H型CRC发生转移时，可能已经存在一定程度的免疫逃避能力，或者这些发生转移的肿瘤可能本身免疫原性就比较低[5]。

1.2 影响免疫反应的基因改变 ICIs的原发性耐药机制还可以通过宿主免疫系统的生物多样性和肿瘤生物学来解释[6]。Grasso等[7]通过对肿瘤样本分子特征进行研究，分析了179例dMMR/MSI-H型mCRC患者的免疫逃避机制。结果发现，与pMMR/MSS型mCRC相比，dMMR/MSI-H型mCRC在重要的免疫调节途径和抗原递呈机制中有很高的基因突变率，存在多种导致免疫逃避的基因改变，包括β2微球蛋白(β2-MG)的双等位基因丢失和人类白细胞抗原(HLA)中的单拷贝丢失等；此外，研究还发现了免疫应答中涉及T细胞应答、B细胞发育和自然杀伤细胞功能的基因改变。总的来说，这项研究确定了许多潜在的机制，这些机制可能主要涉及免疫逃避和ICIs的原发耐药性。

1.3 肿瘤代谢与免疫应答 Vasaikar等[8]进行的一项蛋白基因组学研究，探索了dMMR/MSI-H型mCRC的代谢，发现糖酵解与CD8+T细胞浸润之间存在负相关，提示糖酵解增加的肿瘤可能产生过多的乳酸，这是CD8+T细胞的负调控因子。Riaz等[9]探索了ICIs的疗效机制，结果显示ICIs在已存在肿瘤反应性效应T细胞[10]和其他免疫系统成分(例如辅助性T细胞)的患者中更有效。因此，在dMMR/MSI-H型mCRC患者中观察到的原发性耐药，可能与有限的细胞毒T淋巴细胞(CTL)[6]以及缺乏预先存在的肿瘤抗原反应性T细胞有关[11]。另外，FOXP3+调节性T细胞(Treg)在免疫调节中的作用也被广泛研究。目前的证据表明，它可以通过多种途径抑制CTL，如分泌转化生长因子β(TGF-β)对CTL发挥抑制作用，从而抑制免疫应答[12]。肿瘤内Treg与CTL相对比例的增加，已被确定为包括CRC在内的多种实体瘤的不良预后因素[13]，表明肿瘤内Treg可能是抑制免疫应答和促进癌症进展的重要决定因素。

1.4 髓源性抑制细胞(MDSC) MDSC是骨髓来源的一群异质性细胞，是树突状细胞、巨噬细胞和(或)粒细胞的前体。MDSC具有多种功能：①诱导一氧化氮合酶、精氨酸酶-1和吲哚胺2,3-双加氧酶的表达；②促进细胞因子的分泌，如白细胞介素10(IL-10)和TGF-β；③通过细胞接触抑制T细胞介导的肿瘤杀伤作用，抑制免疫识别和促进免疫逃避[14]。是否能将这些负性调节细胞整合到生物标记系统(例如免疫评分)[15]中，为更好地识别受益于ICIs的患者人群提供依据是今后的研究方向。

1.5 dMMR、MSI-H状态一致性的问题 Cohen等[16]发表在JAMA上关于dMMR或MSI-H型CRC对ICIs原发性耐药的简要报告中提到，来自NCT02460198和NCT02060188研究的38例患者，5例(13%)对ICIs有原发性耐药；之后对这5例患者MSI、dMMR状态的重新评估表明，这5例中有3例(60%)是pMMR/MSS型mCRC。在3例被误诊为dMMR/MSI-H的mCRC患者中，有1例同时接受了免疫组化(IHC)和PCR两种方法的筛查，而另外2例只接受了IHC或PCR中的一种。Cohen等[16]建议，在使用ICIs治疗前应使用IHC和PCR进行双重测试，结果不一致时将其转到专家诊断中心，以降低dMMR/MSI-H假阳性率。

1.6 新抗原、免疫原性和突变负荷 众所周知，dMMR/MSI-H型mCRC由于MMR缺陷导致的移码突变而具有较高的肿瘤突变负荷。DNA序列的这些主要变化导致新抗原形成，使dMMR/MSI-H型mCRC具有较高的免疫原性。这一特点提出了有关DNA结构突变结果的重要因素：数量与质量。导致蛋白质抗原结构改变的突变比点突变引起的蛋白质中单一或有限的氨基酸变化更能有效地产生免疫应答，后者由于保存了抗原结构和缺乏免疫原性表位，可能无法诱导强大的免疫应答。例如，KRAS点突变通常表现出非常有限的免疫原性[17],并导致癌基因激活，这是多个实体肿瘤发生和进展的重要步骤[18]。此外，ICIs对高突变负荷的肿瘤更有效[19]。尽管突变负荷被认为是各种新抗原存在的替代物，但是突变的数量可能与产生T细胞反应的突变的质量无直接关系[20]。

2 dMMR/MSI-H型mCRC患者ICIs获得性耐药机制

虽然使用ICIs治疗dMMR/MSI-H型mCRC是一个相对较新的方法，但已观察到对治疗的获得性耐药[21]，其发生的机制可能涉及以下几个方面。

2.1 Wnt信号通路异常 Wnt/β-catenin信号通路可能在肿瘤微环境(TME)的免疫调节中发挥重要作用[22]。Spranger等[23]研究表明，在小鼠原发性黑色素瘤模型中，过度激活Wnt/β-catenin信号通路可减少T细胞向TME的浸润，从而降低ICIs的疗效。另外，Yaguchi等[24]的研究表明，Wnt/β-catenin信号通路的过度激活可能通过减少γ干扰素(IFN-γ)水平来抑制CTL的效应功能。这些观察结果表明，Wnt信号通路过度激活可能损害免疫识别，导致免疫逃避[16]。

2.2 TGF-β家族细胞因子释放 多项研究显示，TGF-β家族细胞因子可能对免疫系统和抗肿瘤免疫起着重要作用。例如:①TGF-β可以通过上调FOXP3基因的表达诱导原始CD4+T细胞转化为Treg[25]；② TGF-β也可能参与维持FOXP3+Treg的免疫抑制功能[26]；③TGF-β还可能抑制穿孔素、颗粒酶A/B和Fas配体的表达，从而减弱CTL的效应功能[27]。然而，目前尚不清楚TGF-β在ICIs治疗dMMR/MSI-H型mCRC患者中的确切作用，需要进一步研究。

2.3 JAK基因突变 JAK是非受体酪氨酸激酶家族的成员，它们在肿瘤细胞中起促进生长的作用，同时通过多种机制调节免疫反应[28]。Sucker等[29]报道了JAK2基因突变可导致黑色素瘤患者IFN-γ抵抗增加，随后抗PD-1治疗失败。Sveen等[30]针对dMMR/MSI-H型mCRC患者的突变分析研究表明，JAK1的纯合缺失可能与抗PD-1治疗的耐药有关。然而，研究结果并不完全一致，一项在Nivolumab和Ipilimumab联合治疗40例dMMR/MSI-H型mCRC患者中进行的回顾性研究发现，有4例出现JAK1功能丧失突变，似乎并没有影响治疗效果[31]。上述研究表明，与JAK1或JAK2单个基因突变相比，JAK1/2双等位基因缺失可能是预测免疫治疗反应更好的生物标志物。

2.4 T细胞功能的表观遗传调控 随着对T细胞衰竭认识的不断深入，发现T细胞衰竭削弱了ICIs的疗效。人们开始重视T细胞表型和功能的研究，可能还影响免疫检查点阻断反应持久性的基因甲基化。Youngblood等[32]报道，慢性病毒感染可能会使PD-1位点发生甲基化，导致T细胞耗竭以及免疫应答在早期终止。同样，Ghoneim等[33]通过应用全基因组亚硫酸氢盐对抗原特异性鼠CD8+T细胞进行测序的研究发现，抗PD-1治疗不能完全阻断与T细胞衰竭相关的DNA甲基化程序，这些程序降低了T细胞扩增的能力以及克隆多样性，从而导致获得性耐药。总之，这些数据表明PD-1启动子甲基化和其他遗传修饰可能是ICIs失效的关键原因，但在CRC中仍需要进一步探索。单细胞测序技术的深入研究，将会帮助我们对MSI、MSS以及其他突变与T细胞表观遗传之间的关系有更加深层次的理解。

3 展望

虽然ICIs是dMMR/MSI-H型mCRC患者的一种安全有效的治疗选择，但是耐药是需要我们面对的一个问题。因此，我们需要进一步的临床和转化研究，以更好地了解耐药机制并寻找解决方法。对于原发性耐药的患者，TME的全部特征至关重要。例如，缺乏CTL浸润、Treg与CTL相对比例的增加或存在其他免疫抑制细胞，可能是主要的耐药机制。在FOXP3+Treg浸润增加的患者中，使用ICIs结合针对Treg的药物可以产生治疗效果。癌症疫苗或嵌合抗原受体T细胞等方法可能在缺乏CTL浸润的患者中带来新的治疗机会。对于获得性耐药的患者，是否可以联合其他特定靶向药物、放疗或化疗等方法来改善耐药仍需要更多的探索。值得注意的是，Gopalakrishnan等[34]研究表明，肠道微生物群可能与实体瘤中的ICIs疗效有关；尽管对于肠道微生物群中可能增强ICIs疗效的特定菌群尚未达成共识，但当患者接受抗PD-1和抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫治疗时，发现多个肠道菌群与预后有关。肠道微生物群对ICIs反应的调节作用可能创造新的治疗机会，应在具有耐药的dMMR/MSI-H型mCRC患者中进行检测。目前，多学科融合为深入了解癌细胞与TME之间的关系提供了前所未有的视角，包括组织病理学、基因组学、免疫分析、单细胞转录组学、T细胞受体特性、新抗原预测、体外T细胞操作、不断增长的免疫检查点调节剂、细胞疗法和疫苗，以及提供关于免疫耐药机制真实数据的临床试验。希望这些知识的激增能进一步改进药理学策略，使dMMR/MSI-H型mCRC免疫治疗的耐药问题得以解决。