ERK抑制剂U0126对缺糖缺氧再灌注损伤神经母细胞瘤细胞的保护作用

王奕海，吕倩，胡婉湘，李德丽，谢露

广西医科大学，南宁530021

缺血性脑卒中是一种严重的神经系统疾病，发病年龄趋向于年轻化，致残率和病死率都很高[1]。脑卒中主要是由于脑部血管阻塞，导致大脑氧供应缺乏，脑神经损伤[2]。目前，缺血性脑卒中的主要治疗方式是及时恢复脑血流即再灌注[3]，然而缺血再灌注会引起大脑组织发生一系列病理生理变化，最后导致不可逆的脑损伤[4,5]。越来越多的证据表明，细胞凋亡相关的信号激活、基因表达和程序调控是脑缺血缺氧再灌注损伤的重要病理机制[6]。因此，探索干预细胞凋亡途径的抗脑缺血缺氧再灌注损伤的药物具有重要意义。细胞外信号调节激酶(ERK)为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成员之一，可被氧自由基、炎症因子所激活，介导DNA损伤、细胞凋亡和坏死[7,8]。研究发现，ERK抑制剂U0126则可保护神经细胞免受氧化应激引起的细胞凋亡[9]。目前，有关U0126对缺糖缺氧再灌注(OGD/R)神经细胞保护作用的研究还很少。2016年3月～2019年11月，我们以神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y为研究对象，在体外构建OGD/R模型以模拟脑缺血缺氧再灌性损伤，观察U0126对OGD/R的SH-SY5Y细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)活性及凋亡蛋白cleaved-Caspase3表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 SH-SY5Y细胞购自武汉大学细胞库，MEM培养基、胎牛血清和L-谷氨酰胺购自Gibco公司；CCK-8、DMSO购自美国Sigma公司，Hoechst 33258染色试剂盒、LDH检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；U0126购自美国Selleck公司；一抗(Caspase3 Rabbit mAb)、二抗(anti-Rabbit IgG)购自Cell Signaling Technology公司，PBS、0.25% EDTA胰酶、1%青霉素-链霉素、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、蛋白上样缓冲液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、30%丙烯酰胺均购自北京索莱宝有限公司。5% CO2培养箱购自美国Thermo Scientific公司，超净工作台购自苏州净化设备有限公司，酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司，荧光倒置显微镜购自日本Olympus公司，Odyssey双红色外荧光扫描成像系统购自美国LI-COR公司。

1.2 OGD处理时间确定 SH-SY5Y细胞在镜下观察约90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化并制成细胞悬液；调整细胞密度为1×104/mL，种植于96孔板内，每组设置6个复孔。培养24 h后吸弃培养液，用37 ℃预热的PBS清洗细胞，加入无糖DMEM；将培养板放在经高压灭菌过的密封盒内，持续向盒内通入100%的氮气5 min，随后放入37 ℃恒温箱中培养0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h。将无糖DMED换成完全培养基，放入5% CO2培养箱中培养24 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，继续培养2 h，用酶标仪检测OD值(单波波长450 nm)。细胞存活率=(模型组OD值-模型空白孔OD值)/(对照组OD值-对照空白孔OD值)×100%。实验重复3次。OGD处理0.5、1、1.5、2、2.5、3 h后细胞存活率分别为89.03%±3.99%、81.58%±3.05%、75.65%±5.77%、55.65%±1.95%、43.65%±3.71%、34.54%±2.78%。选取细胞存活率在50%～60%的作用时间段，即OGD 2 h作为后续实验条件[10]。

1.3 细胞分组、模型制作及U0126干预 SH-SY5Y细胞复苏后接种于含5%胎牛血清、1%青霉-链霉素、1% L-谷氨酰胺的高糖MEM中，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心5 min，细胞经重悬后传代、铺板，取对数生长期细胞做实验。取生长状态良好的SH-SY5Y细胞，随机分为正常对照组(Control组)、DMSO组(DMSO组)、模型组(OGD/R组)、U0126低剂量组(U0126-L组)、U0126中剂量组(U0126-M组)、U0126高剂量组(U0126-H组)。Control组和OGD/R组加入完全培养基，DMSO组加入含0.06%的DMSO培养基，U0126-L组、U0126-M组、U0126-H组分别加入终浓度为10、20、30 μmol/L的培养基。正常培养24 h后，Control组和DMSO组加入正常培养基，常规培养。OGD/R组、U0126-L组、U0126-M组、U0126-H组用37 ℃ PBS轻洗1次，换成无糖培养基，OGD(100%氮气37 ℃)处理2 h后，换成正常培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。

1.4 细胞存活率测算 收集各组细胞，按照CCK-8检测试剂盒说明书测算细胞存活率。

1.5 LDH活性检测 收集各组细胞培养液，按照LDH检测试剂盒说明书检测LDH。

1.6 细胞核形态观察 各组细胞弃去培养基，6孔板中每孔加入500 μL的细胞固定液30 min，弃固定液；预热PBS洗2次，3 min/次；加Hoechst33258染色液500 μL，室温5 min；去染色液，用预热PBS洗2次，3 min/次，弃去PBS；荧光显微镜观察并拍照。

1.7 细胞中cleaved-Caspase3蛋白检测 收集各组细胞，按照蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒提取蛋白并检测蛋白浓度。每个样本加样量为60 μg；用SDS-PAGE分离后转至0.22 μm的PVDF膜上，用脱脂奶粉封闭2 h；放入一抗(1∶500)孵育盒中，4 ℃冰箱中过夜，TBST洗膜5次，每次5 min；应用IRDye800CW偶联二抗激发远红外荧光的二抗(1∶1 000)室温孵育2 h，TBST洗膜5次，每次5 min。应用Odyssey双红外荧光扫描成像系统拍摄PVDF膜蛋白条带并分析蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞存活率比较 Control组、DMSO组、OGD/R组、U0126-L组、U0126-M组、U0126-H组细胞存活率分别为100%、97.05%±2.64%、59.05%±1.67%、78.43%±3.03%、83.31%±3.94%、91.62%±6.51%，细胞存活率Control组、DMSO组>U0126-H组>U0126-M组>U0126-L组>OGD/R组(P均<0.05)，Control组与DMSO组差异无统计学意义。

2.2 各组细胞培养液中LDH活性比较 Control组、DMSO组、OGD/R组、U0126-L组、U0126-M组、U0126-H组细胞培养液中LDH活性分别为(250.00±7.76)、(255.50±2.15)、(282.27±3.17)、(277.95±4.30)、(271.20±1.42)、(262.96±1.36)U/L，细胞培养液中的LDH活性Control组、DMSO组

2.3 各组细胞核形态 Hoechst33258染色结果显示，与Control组比较，DMSO组细胞核形态无明显改变；OGD/R组核膜破裂，细胞核固缩，染色加深明显，细胞数目明显减少；U0126-L组、U0126-M组、U0126-H组核染色变浅，细胞数目增多。

2.4 各组细胞中Caspase-3蛋白表达比较 Control组、DMSO组、OGD/R组、U0126-L组、U0126-M组、U0126-H组细胞中cleaved-Caspase3相对表达量分别为0.16±0.01、0.16±0.02、0.31±0.02、0.26±0.02、0.20±0.02、0.22±0.05，cleaved-Caspase3相对表达量Control组、DMSO组0.05)。

3 讨论

研究发现，在OGD/R过程中，活性氧(ROS)过度产生可通过激活ERK通路引起细胞的凋亡和坏死[11]。本课题组前期研究通过经食管电刺激诱发心室颤动，建立全脑缺血再灌注大鼠模型，观察到动物复苏后脑ROS、丙二醛(MDA)含量增加，SOD表达降低；同时，ERK通路被明显激活，伴随神经细胞凋亡增加。在大鼠自主循环恢复后静脉注射ERK抑制剂PD98059，在降低p-ERK蛋白表达的同时，可有效降低ROS和MDA水平，提高SOD活性，减轻细胞凋亡和自噬，改善心跳骤停/心肺复苏后大鼠生存率、延长生存时间、改善神经功能[11～13]。由此可认为，脑缺血再灌注促进ERK通路的激活，而抑制其磷酸化则起到抗凋亡、保护脑组织的作用。有研究表明，ERK抑制剂U0126通过抑制ERK1/2通路保护多巴胺能神经元免受炎症、神经毒性、自噬介导的细胞凋亡[14～16]。

本实验通过观察细胞存活率、细胞核形态、LDH活性和cleaved-Caspase3的表达来分析U0126对SH-SY5Y细胞的保护作用机制。我们采用SH-SY5Y细胞构建OGD/R模型，并给予U0126预处理，发现U0126-L组、U0126-M组、U0126-H组细胞存活率高于OGD/R组。Hoechst33258荧光结果显示，与Control组比较，DMSO组细胞核形态无明显改变；OGD/R组核膜破裂，细胞核固缩，染色加深明显，细胞数目明显减少；U0126-L组、U0126-M组、U0126-H组核染色变浅，细胞数目增多。这表明U0126预处理可提高OGD/R细胞的存活率，减少细胞凋亡，与上述研究结果相符。

在OGD/R过程中，ROS对细胞膜的攻击可使细胞膜的完整性遭破坏，细胞内LDH释放至胞外。LDH参与糖酵解和乳酸生成，存在于各种组织细胞的细胞质中。LDH的释放与细胞膜完整性的破坏有关，较高的LDH水平表示细胞膜完整性受损[17]。本研究结果显示，OGD/R组细胞培养液中LDH活性高于Control组，U0126-L组、U0126-M组、U0126-H组LDH活性低于OGD/R组，表明U0126能降低培养液中LDH活性，提示U0126可通过抗氧化作用，维护细胞膜的完整性，从而阻抑细胞凋亡的发生。

凋亡蛋白Caspase3是细胞凋亡的执行者，为典型的细胞凋亡标志物[18]。本研究结果显示，OGD/R组cleaved-Caspase3相对表达量高于Control组、DMSO组，U0126-L组、U0126-M组、U0126-H组cleaved-Caspase3相对表达量低于OGD/R组，提示U0126能减少cleaved-Caspase3表达，其对激活Caspase3的上游途径有阻滞影响。有研究发现，PD98059能够作用于凋亡途径的不同环节，如抗氧化、维护线粒体形态与功能、上调抗凋亡因子的表达等[17,19,20]。U0126是另一种ERK抑制剂，我们将在本研究基础上进一步探索U0126抗细胞凋亡的作用靶点，与其他ERK抑制剂进行比较。

综上所述，在本研究中我们初步观察到ERK抑制剂U0126对SH-SY5Y细胞缺糖缺氧再灌注性损伤有明显抑制作用，可提高细胞存活率，减轻细胞损伤，减少细胞凋亡，具体机制还有待于更多的实验进行探索。