KPT-6566对肺癌细胞增殖、侵袭、凋亡的影响及机制

陈璐，何嘉文，李姝君

1开平市中心医院，广东开平 529300；2广东医科大学附属医院

肺癌已成为世界各国普遍关注的公共卫生问题[1]。据统计，肺癌患者数占全球癌症患者总数的11.6%，是导致癌症患者死亡的首要原因[2,3]。肽脯氨酰基顺反异构酶1(Pin1)是一类进化上十分保守的肽脯氨酰基顺反异构酶家族成员，最初报道于1996年，是由酵母双杂交筛选得到且功能特异、保守的蛋白质[4]。Pin1蛋白由163个氨基酸残基组成，相对分子质量为18 kD。Pin1蛋白质能特异性地催化底物蛋白质中磷酸化的丝/苏-脯氨酸基序(pSer/Thr-Pro)发生顺式和反式间的异构转化，改变其性质及亚细胞定位，进而调节底物蛋白质磷酸化后的功能[5,6]。Pin1在细胞分化、增殖、凋亡等活动中发挥重要调节作用，其功能失调可导致一系列生命活动紊乱。研究表明，Pin1异常高表达与恶性肿瘤细胞的发生发展密切相关，包括肺癌、肝癌、鼻咽癌、白血病、乳腺癌等，表明Pin1是肿瘤诊治的良好靶标[7～10]。KPT-6566是一种新型的Pin1小分子抑制剂，研究表明，KPT-6566可在体内外抑制宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等细胞的增殖和迁移能力[11,12]。截至目前，KPT-6566对肺癌细胞的抑制作用研究鲜见报道。2019年4-11月，我们探讨了KPT-6566对肺癌A549细胞增殖、侵袭、凋亡的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 肺癌细胞株A549购自ATCC公司；KPT-6566药物购自上海陶术生物科技有限公司；胎牛血清购自Gibco公司；DMEM培养基和胰酶购自BI公司；DPBS缓冲液购自索莱宝公司；兔抗Ras、Raf、MEK、ERK单克隆抗体购自CST公司；兔抗PI3K、AKT单克隆抗体购自Abcam公司；兔抗MCL-1、MYC和Pin1单克隆抗体购自ProteinTech公司；TBST缓冲液购自碧云天生物有限公司；CCK-8增殖试剂盒购自日本Dojindo公司；引物由广州艾基生物技术有限公司合成，反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Transwell小室购自Corning公司；APC/PI双染凋亡试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司；结晶紫染色液购自上海碧云天生物技术有限公司；倒置显微镜购自德国Leica公司；细胞孵箱购自美国Thermo科技公司；超净工作台购自苏州设备净化设备厂。

1.2 A549细胞培养与分组 将A549细胞置于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基(常规加入双抗：100 mg/L链霉素和100 kU/L青霉素)普通细胞培养箱中培养，待细胞密度70%～80%则扩瓶传代培养。选取生长状态良好的A549细胞用于实验，分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，低、中、高剂量组细胞培养液中分别加入终浓度为2.5、5和10 μmol/L KPT-6566溶液，对照组细胞则加入等体积的完全培养基。

1.3 细胞存活率测算 96孔培养板中接种肺癌A549细胞，数量为5×103/孔，普通细胞培养箱中培养24 h后充分去除细胞培养基，分别加入对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组培养液，每组实验设置3复孔，完全培养基组为空白组。各组细胞于培养箱中孵育24 h后加入CCK-8溶液，剂量为10 μL/孔，继续放入培养箱中培养4 h。取出培养板并借助全波长酶标仪检测450 nm处吸光度值(OD值)，计算细胞存活率以评估癌细胞增殖能力。细胞存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.4 细胞克隆能力检测 将肺癌A549细胞以2×102/孔数量接种于6孔板中，细胞贴壁后充分去除培养基，分别加入对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组培养液。细胞于孵箱中继续培养2周后用PBS缓冲液清洗3次。4%多聚甲醛固定1 h，PBS缓冲液清洗2次。结晶紫染色1 h后用PBS缓冲液充分洗涤，晾干，倒置显微镜下计算各组细胞克隆形成个数。

1.5 细胞侵袭能力检测 使用DMEM培养基充分湿润Transwell小室，加入50 μL Matrigel胶工作液，晃匀后置于24孔板中并放入培养箱中孵育0.5 h，备用。各组A549细胞以200 μL体积接种于Transwell上室，下室加入相应组别的药物培养基500 μL(胎牛血清浓度为20%)，保证上下室药物浓度一致。将培养板置于细胞培养箱中继续培养24 h，实验终点时，充分去除上下室培养液，加入4%多聚甲醛溶液固定1 h后使用生理盐水清洗3次。加入结晶紫染色液充分染色40 min，移除染色液后用棉棒轻轻拭去残余Matrigel胶，Transwell小室于水流下充分清洗掉残存胶和染色液，倒扣放置晾干。倒置显微镜下观察并计算各组侵袭细胞数目。

1.6 细胞凋亡比例检测 将肺癌A549细胞以5×105/孔数量接种于6孔板中，贴壁培养过夜，充分去除培养基后用无菌PBS溶液冲洗1次，分别加入对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组培养液，每组实验设置3复孔，置于细胞培养箱中培养24 h。实验终点时，收集各组细胞离心并用无菌PBS溶液清洗2次，每管细胞以100 μL Binding buffer重悬，按照凋亡试剂盒说明书指示，避光条件下加入PI和APC各5 μL，置于4 ℃冰箱中避光孵育0.5 h，BD流式仪检测细胞凋亡比例。

1.7 各组细胞中Pin1、PI3K、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、GAPDH mRNA表达检测 各组细胞培养1 d后，利用TRIzol溶液裂解并提取细胞总RNA，将细胞总RNA逆转录成cDNA并储存于-80 ℃冰箱备用。以cDNA为模板，以GAPDH为内参，进行实时荧光定量PCR扩增。引物序列如下： Pin1正向引物为5′-TCGAGGGCCGAATTGTTTC-3′,反向引物为5′-GCTGCCGCATGAGTGTTC-3′； MCL-1正向引物为5′-CAAGAGTCCACAGACCTTTCATC-3′,反向引物为5′- TGTCACAGCACCCATGGTAT -3′；PI3K正向引物为5′-CCTCGGTGATATGGGAAAGAGA-3′,反向引物为5′-AGCCGAAACCAGCTCACTCA-3′；AKT正向引物为5′-GGCCTCAGCCCTCAGAAC-3′,反向引物为5′-TGCCACATTGCGCATAGCT-3′；MYC正向引物为5′-CACATGCCCAAGATTCACTGATAG-3′,反向引物为5′-GAGGTGGCTTGGACAGGTTAG-3′；Ras正向引物为5′-TTGTGGGACATATGCAGTGTG-3′,反向引物为5′-TCACTTCACAGCACATACTCCTA-3′；Raf正向引物为5′-TGACTCCTGTAAGGGAGAGGAAAG-3′,反向引物为5′-AGTCGCCATAAGGTTTGGAGTG-3′；MEK正向引物为5′-AGCCCACCAGCCAATGGAC-3′,反向引物为5′-TCAAGCGTCTAAGGGTTTACAAAC-3′； ERK正向引物为5′-TGCTCTGCATGTGGTAACTTG-3′,反向引物为5′-GAACCCTAGGAGCACTGACATC-3′；GAPDH正向引物为5′-CCTGCACCACCAACTGCTTAG-3′,反向引物为5′-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。建立20 μL qRT-PCR扩增体系，包含SYBR Green溶液10 μL，10 μmol/L 的相应基因上反向引物溶液各0.8 μL，cDNA 2 μL和DEPC水6.4 μL。PCR反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共进行40个循环。内参基因选用GAPDH，利用2-ΔΔCt法分析各组细胞中Pin1、PI3K、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK mRNA的相对表达量。

1.8 各组细胞中Pin1、PI3K、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK 、GAPDH 蛋白表达检测 收集各组KPT-6566药物处理24 h后的A549细胞，使用无菌PBS溶液清洗2次。配制全细胞裂解液并向各组细胞中加入适量全细胞裂解液，置于冰上充分裂解20 min，12 000 r/min离心12 min后收集蛋白上清液并使用Bradford试剂盒检测各组细胞蛋白浓度。配制相应浓度的SDS-PAGE凝胶，每个泳道加入30 μg蛋白溶液，80 V恒压电泳约100 min，裁截合适大小的目的凝胶条带并盖上合适大小的PVDF膜，湿转法250 mA恒流转膜约100 min。转膜结束后将PVDF膜放置于5%脱脂牛奶溶液中封闭1.5 h，配制相应一抗溶液并将PVDF膜放置于抗体溶液中孵育过夜。TBST溶液清洗PVDF膜3次，每次8 min。室温下孵育相应的二抗溶液1.5 h，TBST溶液清洗4次，每次12 min。仔细沥干PVDF膜并加入ECL显影液，利用Tanon成像仪显影。使用Image J软件分析各组细胞蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞存活率比较 对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞培养24 h后细胞存活率分别为100.00%±3.34%、80.80%±4.46%、55.75%±5.98%、29.98%±1.88%，组间相比P均<0.05。

2.2 各组细胞克隆形成能力比较 对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞克隆形成个数分别为(155.33±12.76)、(123.33±12.71)、(62.00±9.90)、(28.00±9.09)个，组间相比P均<0.05。

2.3 各组细胞侵袭能力比较 对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞侵袭细胞数分别为(113.33±6.55)、(80.67±6.02)、(47.33±3.30)、(20.33±3.30)个/HP，组间相比P均<0.05。

2.4 各组细胞凋亡率比较 对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞凋亡率分别为5.81%±1.26%、14.81%±1.59%、36.04%±2.30%、63.23%±3.36%，组间相比P均<0.05。

2.5 各组细胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K mRNA相对表达量比较 对照组细胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K mRNA相对表达量分别为1.00±0.06、1.00±0.10、1.00±0.10、1.00±0.14、1.00±0.06、1.00±0.05、1.00±0.09、1.00±0.07、1.00±0.06，低剂量组细胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K mRNA相对表达量分别为0.80±0.03、0.81±0.03、0.72±0.05、0.76±0.06、0.82±0.03、0.83±0.04、0.77±0.03、0.76±0.05、0.79±0.05，中剂量组细胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K mRNA相对表达量分别为0.52±0.05、0.62±0.03、0.48±0.03、0.46±0.05、0.64±0.04、0.66±0.06、0.55±0.06、0.46±0.06、0.58±0.04，高剂量组细胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K mRNA相对表达量分别为0.31±0.04、0.45±0.03、0.26±0.05、0.25±0.05、0.46±0.04、0.49±0.04、0.32±0.05、0.24±0.05、0.39±0.03，组间相比P均<0.05。

2.6 各组细胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K蛋白相对表达量比较 对照组细胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K 蛋白相对表达量分别为1.00±0.14、1.00±0.12、1.00±0.07、1.00±0.14、1.00±0.07、1.00±0.07、1.00±0.04、1.00±0.15、1.00±0.06，低剂量组细胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K蛋白相对表达量分别为0.72±0.04、0.80±0.02、0.77±0.06、0.71±0.04、0.78±0.03、0.82±0.03、0.75±0.05、0.76±0.04、0.79±0.03，中剂量组细胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K蛋白相对表达量分别为0.41±0.03、0.66±0.06、0.58±0.03、0.52±0.03、0.57±0.03、0.69±0.04、0.55±0.05、0.58±0.04、0.52±0.05，高剂量组细胞中Pin1、AKT、MCL-1、MYC、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K蛋白相对表达量分别为0.17±0.03、0.47±0.03、0.42±0.03、0.35±0.06、0.33±0.06、0.48±0.03、0.35±0.06、0.35±0.05、0.23±0.05，组间相比P均<0.05。

3 讨论

人类Pin1基因位于19号染色体，编码的蛋白质由163个氨基酸残基组成，包含两个结构域，分别为WW(色氨酸—色氨酸)中心区和PPIase(肽基脯氨酰顺反异构酶)区。WW区以两个恒定的色氨酸为特征，可介导酶与底物识别；PPIase区包含活化位点，能够高效地催化蛋白质氨酰残基N-末端的肽键发生顺反异构。另外，WW区与PPIase区中间由可变序列连接[13,14]。前期研究表明Pin1异常高表达于肺癌细胞，与肿瘤细胞的发生发展密切相关，导致肺癌患者预后不良，表明靶向Pin1是拓展肺癌治疗的新方向[15～17]。KPT-6566是一种新型的Pin1小分子抑制剂，以共价键形式结合于Pin1催化活性区-PPIase区，PPIase活性IC50为0.64 μmol/L，可介导细胞中Pin1蛋白质发生降解[12]。本实验结果显示，KPT-6566抑制肺癌A549细胞中Pin1的表达水平，显著抑制A549细胞增殖能力。研究表明，沉默Pin1可减弱肿瘤细胞克隆形成能力，增加细胞凋亡比例，阻滞癌细胞生长周期进展，抑制细胞转移活性[18,19]，证明Pin1在恶性细胞生物学活性中发挥着重要作用。本研究发现，Pin1在肺癌细胞恶性生物学活性中扮演着重要的作用，其抑制剂KPT-6566可显著抑制肺癌A549细胞克隆形成活性，增加凋亡细胞比例，减弱癌细胞的侵袭转移能力。

KPT-6566可通过抑制Pin1活性从而调控肺癌细胞恶性生物学功能，但具体机制尚未明确。前期研究显示，PI3K/AKT和MEK/ERK信号转导通路对细胞增殖、迁移及恶性肿瘤血管内皮细胞的生成有重要调节作用，Pin1基因可调控肿瘤细胞中PI3K/AKT和MEK/ERK信号活性，影响PARP、MCL-1表达和DNA损伤从而调节细胞增殖活性[20]。此外，Pin1可协同激活细胞中MYC和NRF2、Raf和FOXM1活性并活化Ras/ERK/NRF2通路，调控癌细胞中线粒体功能和氧化还原稳态，影响抗凋亡蛋白MCL-1活性并介导恶性肿瘤细胞的永生化和化疗耐药作用，促进癌细胞的发生发展，导致临床患者预后不良[21]。与前期研究相似。

本研究发现，Pin1小分子抑制剂KPT-6566可抑制肺癌A549细胞中Pin1介导的PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路活性，降低MCL-1和MYC分子表达量，从而抑制癌细胞增殖和迁移等恶性生物学活性。

综上所述，KPT-6566可阻滞肺癌细胞增殖并促进其凋亡，抑制癌细胞迁移扩散能力，其作用机制可能与Pin1调节PI3K/AKT和MEK/ERK信号转导通路相关。