干粉培养基的研制研究

聂娟　鲁珍娥　易家玲　柳威　朱玉婷

摘 要：本文在简要论述干粉培养基相关理论知识的基础上，深入探讨了干粉培养基研制的材料与工艺方法，并对其研制结果进行深入探讨，给出了干粉培养基研制与工艺优化的实验结论，最后将干粉培养基的研制工艺带入实际应用，综述了干粉培养基的实践应用价值和前景展望，旨在为我国干粉培养基研制水平的不断提高和应用价值的进一步凸显提供更多参考与启迪。

关键词：干粉培养基;研制;应用价值

目前，不论是生物学界还是医学界，所使用的培养支原体培养基绝大部分是以美国学者所发明的肉汤或琼脂为基础的干粉培养基，且英国、美国、日本等诸多发达国家已然将干粉培养基商业化和工业化，为工业生产做出了不可忽视的重要贡献。我国20世纪50年代初，上海生物制药品所就开始生产与不断应用干粉培养基。就现阶段而言，国内生产干粉培养基往往采用高温烘干后再球磨的方式，实际生产质量较为不稳定，产量受生产工艺限制有所缺憾。在此背景下，对干粉培养基的研制研究也就具备了重要理论意义和现实价值，能有效改善我国当前干粉培养基研制效率、生产效率不高的不良状况，不断优化干粉培养基的研制工艺流程，从而为干粉培养基的商业化和工业化提供一定技术支撑。

1 干粉培养基概述

干粉培养基主要是指将培养基的各种成分经过一定的化学处理或物理处理，将培养基实际配方中所需的各种成分以一定量充分混合搅匀，使培养基配方呈现粉末状态，并提取此时充分混合的粉末状态，按照一定比例加入蒸馏水后熔化，分装灭菌后即可投入工业生产的培养基种类。整体而言，干粉培养基生产具备工艺标准化，节约培养基单个制造时间，且实际生产质量较为稳定等诸多优势，是适用于一般流动性及其设备简单的小型化学实验室使用的重要培养基类别之一，受到了诸多小型实验室的强烈欢迎，也为小型实验室实验的正常推进做出了重要贡献。我国从21世纪50年代初期着手研制干粉培养基，干粉培养基在现代医药单位已广泛投入使用，无菌干粉培养基甚至列入了我国相关标准规程。

2 干粉培养基的研制与工艺优化

2.1 材料与方法

在干粉培养基的研制与工艺优化过程中，本文选择血清干粉培养基的生产为主要研制对象，选择Cho细胞以及上海某抗体药物工程研究中心所提供的培养基原材料。进一步将干粉培养基以40、60、80和100℃作为四个温度分界点，实际处理时间为10h。在使四个具备温度点设定的干粉培养基与原方法处理的干粉培养基成为对照实验，四个温度点中的每个温度点各增加两个平行试验，最大限度消除实验误差可能带来的不良影响。在干粉培养基细胞培养过程中，主要将细胞放置于初始原始细胞密度接近于1L的摇瓶，以十天为细胞培养时间。在整个培养过程中，确保摇瓶中的pH值不低于6.8，一旦pH值低于6.8，即进行补碱工作，确定培养基中每天的糖分为3g/l，培养温度为37℃恒温状态，二氧化碳体积分数为5%左右，实际培养基摇瓶转速为125转/min。同时，试验人员还应在细胞培养过程中每天取样一定量细胞进行计数，在培养液1万转/s的离心状态下离心5min，使离心后的液体可用于实验理化数据参数分析。最后，选择干粉培养基的分析方法，可采用细胞计数、葡萄糖乳酸测定方法甚至蛋白表达量测定方法等。

2.2 结果与讨论

首先，探究不同温度条件下所处理的培养基对培养基中活细胞密度的影响，在100℃的状态下，干粉培养基中的活细胞密度最低，深入分析造成该现象的原因可知，可能是由于干粉培养基中某些物质成分在100℃的高温状态处理下，会存在着部分物质成分损失以及营养成分减少等问题，严重影响培养基中细胞的生长与繁殖，造成活细胞密度较低这一不良现象。在培养基的磨制过程中，实际磨制工艺在瞬时温度高达80℃以上时，对培养基中的部分热敏感物质就会有较大破坏。

其次，探讨不同温度处理下的培养基对乳酸的最终影响，在100℃、80℃左右时，乳酸生产质量浓度最高，高达1.75克/升以上。在60℃时，乳酸浓度处于集中状态，40℃和对照组的实验结果显示乳酸浓度处于最低状态。由于乳酸浓度较高，会直接抑制干粉培养基中细胞的实际生长速度和表达方式，由此可知，当乳酸浓度较高时，细胞密度则相对较低。究其原因可知，干粉培养基的实际处理温度较高时，会对培养基成分造成一定影响，例如，会影响培养基中关于谷氨酰胺和转铁蛋白等物质成分，而该类物质成分与干粉培养基中细胞的生长和正常代谢息息相关，直接会影响干粉培养基中细胞的TCL循环。当能量代谢进入了糖酵解阶段或是糖磷酸支路途径时，乳酸浓度快速升高。而乳酸浓度越低，则说明干粉培养基中的实际能量代谢所释放的ATP数量也就越多，越有利于干粉培养基中细胞的生长和正常代谢，乳酸浓度过高，则会影响干粉培养基的细胞能量代谢过程，抑制干粉培养基中细胞的生长和最终表达。

再者，探讨不同温度处理下的培养基对目的蛋白表达量和生产量的影响，其实验结果可知，100℃温度条件下处理的目的蛋白表达量最低，仅仅为2.06g/l，而40℃处理后的目的蛋白表达量和实际生长量与对照组蛋白量和实际生长量最高，分别达到了2.45和2.53g/l，其他温度条件下所处理的目的蛋白表达量均低于40℃状态下的目的蛋白表达量，而100℃时的目的蛋白表达量含量最低。由此進一步探究目的蛋白表达量和生长量受温度的影响可知，由于干粉培养基中的部分成分在100℃的高温条件处理下会存在着部分物质损耗和营养成分的减少。

最后，综合讨论所有培养基实验，对单因素结果和方差进行深度分析，比较不同培养基培养十天后的活细胞密度、乳酸含量以及其目的蛋白的表达量和生长量，并对其进行实验结果和方差数据分析。由试验可知，100℃的温度条件下，活细胞的生长密度最低，而40℃的温度条件下，活细胞的密度最高，其他温度条件下处理的活细胞密度与对照组比较呈现出显著性差异这一数理统计结果。当温度条件为40℃时，pH值大于0.05，也就是数理统计上的非显著性差异。就40℃和对照组的乳酸浓度问题而言，两者处于最低状态，浓度相差较小，呈现非显著性差异，两者数据信息较为接近。从目的蛋白的表达量和生长量来看，40℃和对照组为非显著性差异，其他组与对照组则呈现出了显著性差异，明显高于其他不同条件温度处理下的目的蛋白表达量和生长量。

2.3 结论

本文以不同温度条件处理下的干粉培养基对Cho细胞培养以及目的蛋白表达量和生长量的影响为研究对象，确定了对干粉培养基表达和生产绩效最高的实际处理温度。进一步结合乳酸浓度、干粉培养基活细胞密度以及目的蛋白表达量数据，40℃和对照组远远优于其他实验组别，其中对照组的乳酸浓度最低，实际目的蛋白表达含量最高，但对照组的培养基在其干粉处理工序上较为繁复，实际生产效率较为低下，而40℃实验组处理后的干粉培养基活细胞生长状况与对照组为非显著性差异，实际处理工序却大幅度减少，处理难度进一步降低，生产效率快速提高。综合考虑，40℃的干粉培养基处理工序为最佳处理温度。

3 实际应用与价值

在培养基的实际生产过程中，加强对不同温度条件下培养基原材料的干燥处理以及不同温度条件下培养基中最终细胞生长量、目的蛋白表达量和生产量等的探讨与研究，也就能不断优化无血清培养基的制备流程和工业生产流程，使无血清培养基能在生产成本快速降低和生产时间大量缩减的基础上，不断增强其最终生产质量。总之，无血清培养基的优化处理能为国内动物细胞培养进程提供一定支撑，也能为国内其他抗体产业的发展提供一定思考。

4 前景展望

通过本文对无血清培养基关于不同温度条件下的相关研究，能为无血清培养基在其他影响因素上的工艺流程设计与优化提供一定参考，也能为其他类别干粉培养基工艺流程的缩减和优化提供更多支撑，更能为国内相关生物试验的推进和国内抗体产业的不断扩大提供一定参考。

参考文献：

[1]翁志兵，邵晨华，胡辉.无血清培养基干粉的生产工艺优化[J].生物加工过程，2015，13（5）：57-59.