Tet-on 调控BMP-2 基因表达的腺病毒载体构建＊

温家宾，肖裕华，陈钢，李宇旭，龚飞鹏

（江西省人民医院骨科，南昌 330006）

骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)是一种高效的骨诱导生长因子，它能诱导未分化间充质细胞和骨髓基质细胞分化为成骨细胞，BMP-2 是BMP 家族中第一个确定具有诱导成骨作用的因子。 BMP-2 不仅可以直接促进成骨细胞的分化， 也能够增加成骨细胞标志基因的表达，因此BMP-2 成为骨质疏松性骨折治疗的重要靶点[1]。 由于蛋白类药物在体内的半衰期短，药物生物利用率低，作用于骨折部位的药物浓度低。 因此， 寻求一种时效性的、 能在局部部位高表达BMP-2 的方法是治疗骨折的关键[2]。 本研究拟通过构建带有四环素（tetracycline，Tet）正向调控系统Tet-on 的BMP-2 基因腺病毒载体，利用四环素衍生物强力霉素与骨组织高亲和性， 以及强力霉素在调控系统中起时间开关作用的两大优势， 为研究骨质疏松性骨折的基因靶向性、时效性、可调控的精确治疗提供一种全新的思路和方向。

1 材料与方法

1.1 材料 含目的基因的pDC315-BMP-2 质粒由上海吉凯生物有限公司提供，DMEM 高糖培养基购自美国Gibco 公司， 胎牛血清购自美国Hycolon生物公司， 限制性内切酶Eco31I 购自立陶宛MBI公司，dNTP 购自美国 Promega 公司，Marker 购自北京天为时代生物公司，TaqDNA 聚合酶购自立陶宛MBI 公司，DNA 提取试剂盒购自上海生物工程有限公司，pAdenoX-Tet-On3GVector Adeno-X Rapid Titer Kit、StellarTM Competent Cells 购 自 美国 Clontech 公司，DNA Polymerase、DNA Extraction Kit、In-Fusion ®HD Cloning Kit、Plasmid Purification Kit 均购自日本Takara 公司，购自美国Clontech 公司，EndoFree Plasmid Maxi Kit 购自德国 Qiagen 公司。

1.2．方法

1.2.1 构建腺病毒表达质粒 以含有目的基因的pDC315-BMP-2 质粒为模板，将约1200bp 片段目的基因克隆至pAdenoX-Tet-On 3G Vector 中，构建Tet-on 腺病毒表达质粒。具体操作如下：引物设计遵循 Adeno -XTMAdenoviral System 3 User Manual 说明书进行。 使用 PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase（Takara Code No. R050A），以 pDC315-BMP-2 质粒为模板进行PCR 扩增。将PCR 产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳后， 使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0 （Takara Code No. 9762） 切胶回收目的约 1200bp 大小片段。 使用 In-Fusion® HD Cloning Kit ( Clontech Cat No. 639648 )， 将产物和 pAdenoX-Tet-On 3G Vector Set( Clontech Cat No. 631179 )连接。 使用EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen 货号 12362)提取pAdenoBMP-2-Tet-On 表达质粒。 使用Thermo Fisher Nanodrop2000 超微量可见紫外分光光度计进行定量。

1.2.2 重组BMP-2 基因Tet-on 调控腺病毒 以含有目的基因的无内毒素腺病毒表达质粒为模板，制备单克隆重组腺病毒体。

1.2.2.1 Adeno-X 293 细胞培养 Adeno-X 293 Cell Line( Cat No.632271），培养基为 DMEM（10%FBS），培养条件为 37℃、5% CO2，培养箱中进行培养。 培养基 DMEM（10%FBS）具体配方：90% 高糖DMEM 培养基, 4 mM 左旋谷酰胺, 3.7 g/L 碳酸氢钠以及10%不含四环素的胎牛血清。

1.2.2.2 腺病毒体制备 (1)转染前pAdenoBMP-2-Tet-On 表达质粒溶液制备 在pAdenoBMP-2-Tet-On 表达质粒转染细胞之前，重组质粒必须用Pac I酶进行消化处理， 用以暴露病毒的末端反向重复序列（inverted terminal repeats，ITRs），ITRs 位于病毒基因组末端， 包含了病毒DNA 复制的起始部分，也是构成复制复合体的重要组成部分，所以用PacI 消化暴露ITRs 制备出具有感染力的pAdenoBMP-2-Tet-On 表达质粒溶液是转染前的关键步骤。 (2) pAdenoBMP-2-Tet-On 表达质粒转染 Adeno-X 293 细胞。 在转染前 24h，将 Adeno-X 293 细胞以 1-2×106cells 的密度铺于 60mm 培养皿。培养条件为37℃、5% CO2，培养24h。观察细胞铺满培养皿底约50%-70%，贴壁良好，用10μl 制备好的pAdenoBMP-2-Tet-On 表达质粒溶液转染每个培养皿。 转染后每天显微镜下观察细胞病理现象（cytopathic effect，CPE)，判断病毒是否转染成功。 转染1 周后，完成腺病毒初次扩增，PCR 鉴定扩增产物。

1.2.2.3 含有目的基因的重组腺病毒扩增、 纯化及滴度检测 在转染前24h，将Adeno-X 293 细胞转移至 T75 培养瓶中。 培养条件为 37℃、5% CO2，24h。 当细胞铺满瓶底达50%-70%时，将培养基移去， 重新每瓶中加入含有重组腺病毒的培养基5ml。 转染条件为 37℃、5% CO2，90min。 移去培养基，重新加入10ml 新鲜培养基。 培养条件为37℃、5% CO2，3-4d。 观察 CPE 现象，用 15ml 离心管收集细胞悬液。 用干冰将细胞液冰冻，然后在37℃水浴箱中解冻，反复3 次，分离病毒。 利用Adeno-X Rapid Titer Kit 检测病毒滴度。

2 结果

2.1 目的基因的提取 以含有 BMP-2 基因的pDC315-BMP-2 质粒为模板，提取出约1200bp 片段基因（图 1）。

图1 对pDC315-BMP-2 质粒酶切后成功获得1233bpBMP-2 基因片段（产物1）

2.2 目的基因导入 pAdenoX-Tet-On 3G Vector将 BMP-2 基因片段导入 pAdenoX-Tet-On 3G Vector, 经转染培养后重新酶切产物， 所得质粒（CTG083-2A-10） 测序结果与参考序列完全相同（图2）， 表明目的基因成功和腺病毒Tet-on 载体连接。

图2 Pac I 酶消化后得到特征DNA 条带

2.3 重组腺病毒转染细胞，扩增及滴度测定 重组腺病毒转染Adeno-X 293 细胞后， 观察到CPE 现象（图 3），同时，培养7d 后细胞裂解产物 PCR 产物分析含有目的基因质粒的特征条带（图4）。重组BMP-2 基因Tet-on 腺病毒扩增纯化后滴度测定结果：

CTG083-P4 Adenovirus (2014.01.02)，1000ul，6x109ifu/ml

图3 病毒转染7 天后，细胞出现CPE 现象，镜下观察细胞聚合，为腺病毒感染典型特征

图4 重组腺病毒转染细胞后，培养1 周取细胞裂解产物行3%琼脂凝胶电泳，表明重组腺病毒所含目的基因成功转入细胞内

CTG083-P4 Adenovirus (2014.01.06)，1100ul，1x1010ifu/ml

3 讨论

骨质疏松性骨折是骨质疏松症(osteoporosis，OP)最严重的并发症，它严重危害老年人健康。 由于老年人一般情况差，基础疾病多，骨质疏松程度重，骨折后往往愈合能力差，治疗时间长且伴随风险及死亡率高，给患者、家庭和社会都带来了沉重的负担[3,4]。 因此，如何“又快又好”的治疗老年人骨质疏松性骨折无疑是一项十分具有挑战性的课题。 研究发现，在老年骨质疏松症患者松质骨中，BMP-2 基因表达水平较正常成年人显著降低，证明BMP-2 与老年性骨质疏松骨折的发病有着密切的联系[5]，同时，BMP-2 基因的表达水平与骨质疏松性骨折发生后的愈合过程有着重要的的相关性，在骨折愈合的过程中，BMP-2 表达显著升高[6]。

目前,基因治疗骨质疏松性骨折是一个新兴的热点，如构建重组BMP-2 基因腺病毒或慢病毒载体，进而转染细胞以及骨折部位局部注射，提高局部BMP-2 表达水平，进而促进骨折愈合，已经表明可以成为骨质疏松症骨折基因治疗重要方法[7,8]。但是，对于骨质疏松性骨折而言，其骨折愈合过程中关键的血肿机化期和原始骨痂形成期持续约1-2 个月，其后主要通过功能锻炼达到骨痂改造塑行的目的。 如果BMP-2 基因表达没有在时间上受到调控， 则其在血肿机化演进期和原始骨痂形成期可能表达不足，导致骨折延迟愈合，而骨痂改造塑行期若过度表达,又可能导致骨折的畸形愈合。 同时，如果没有在骨折部位上进行靶向调控，BMP-2基因将不仅仅在骨组织中表达， 也可能会在骨外组织表达而造成异位骨化[9,10]，甚至导致肿瘤[11,12]发生。 所以，如何进一步对BMP-2 进行严密、特异、时效性地靶向调控， 成为了进一步研究的重要方向[13,14]。

Tet-on 系统是目前应用广泛的四环素表达正向调控系统[15]，在没有四环素衍生物强力霉素（doxycycline，Dox）存在时，下游目的基因转录被抑制；加入强力霉素后，下游目的基因得到表达，可以利用强力霉素的开关作用，起到时效性调控的作用。而且，人们发现作为Tet-on 系统“钥匙”的强力霉素具有明显的“骨组织亲合性”，可以和羟基磷灰石结合，组成强力霉素缓释系统，形成强力霉素在骨组织的长期缓慢释放， 具有骨靶向性调控的作用[16]。 在 Zeng 等人的研究中，成功利用 Tet-on 系统调控携带COLIA1 基因的腺病毒时效性、靶向性表达促进骨质疏松骨折大鼠愈合， 证明了Tet-on系统对于骨折愈合基因调控的两大优势[17]。

基于以上治疗方法及发现的问题， 本次研究成功构建Tet-on 调控BMP-2 腺病毒载体，利用强力霉素与骨组织高亲和性和强力霉素在基因调控系统中开关作用的两大优势， 为后期进一步的体外及体内试验奠定了基础。 该重组腺病毒载体的构建成功，将可能使转染后的BMP-2 基因不但能在骨组织中靶向表达， 而且能在血肿机化演进期和原始骨痂形成期时多表达， 而骨痂改造塑行期少表达，达到时效性、靶向性基因治疗改善骨质疏松性骨折愈合作用机制的目的， 同时减少相应的副反应，为骨质疏松性骨折的治疗，提供了一个全新的思路。