转染葡萄糖神经酰胺合成酶小干扰RNA的胃癌细胞株SGC7901、SGC7901/DDP凋亡观察

张俊杰，葛艳丽，王声乐，王喆，王志荣

同济大学附属同济医院，上海200065

胃癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]。化疗是进展期胃癌主要的治疗手段，但肿瘤细胞往往存在多药耐药(MDR)，是肿瘤化疗失败的主要原因，对胃癌MDR的研究一直是一个热点。肿瘤细胞MDR的机制非常复杂，由MDR-1基因编码的P-糖蛋白(P-gp)通过细胞外信号调节激酶(ERK)通路介导是MDR的主要机制之一[2-3]。研究[4-6]表明，葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)与多种肿瘤细胞的MDR密切相关，在肿瘤细胞MDR中的作用渐受重视。但有关胃癌细胞MDR的过程中GCS的作用及机制研究较少。2013年6月1日～2016年12月31日，本研究观察了转染GCS小干扰RNA的胃癌细胞株SGC7901、顺铂耐药胃癌细胞株SGC7901/DDP凋亡情况，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞分组及SiRNA转染 SGC7901及GES-1细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，5%CO2、37 ℃条件下饱和湿度培养。SGC7901/DDP细胞培养条件与SGC7901细胞相同，另在培养基中加入500 ng/mL顺铂，逐渐递增顺铂剂量至800 ng/mL作为维持耐药剂量，并在实验前脱药培养两周。各细胞长满后使用0.25%胰蛋白酶消化液消化、传代，取对数生长期各细胞分为6组，分别记为GES-1组、GES-1+SiRNA组、SGC7901组、SGC7901+SiRNA组、SGC7901/DDP组、SGC7901/DDP+SiRNA组。取各组细胞，胰酶消化后以1×105个细胞铺至6孔板中，待细胞贴壁后，GES-1+SiRNA组、SGC7901+SiRNA组、SGC7901/DDP+SiRNA组细胞采用脂质体2000转染GCS SiRNA，GES-1组、SGC7901组、SGC7901/DDP组细胞转染阴性对照GCS SiRNA，各组细胞继续培养48 h后，收集对数生长期各组细胞用于实验。

1.2 各组细胞凋亡指数测算 取各组细胞，使用PBS重悬，并计数。取1×105个细胞，1 000 r/min离心5 min后弃上清，加入500 μL稀释的1×Annexin V Binding buffer工作液重悬细胞。在细胞悬液中加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的碘化丙啶(PI)染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置20 min，使用流式细胞仪检测凋亡细胞数，计算凋亡指数。凋亡指数=凋亡细胞数/(凋亡细胞数十正常细胞数)×100。

1.3 各组细胞中MDR-1、BCL2、BAX mRNA检测 采用Real-time PCR法。取各组细胞，提取总RNA，紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，建立20 μL RT-PCR逆转录体系，其中RNA模板为1 μL，Oligo dT引物和随机引物各1 μL，PCR缓冲液为4 μL(包含镁离子、dNTPs、甘油等)，逆转录酶为1 μL，其余用DEPC水补足。采用TaKaRa逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行Real-time PCR反应，反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共计40个循环，72 ℃ 3 min，4 ℃退火。引物序列如下：MDR-1上游引物为5′-CAGCTGTTGTCTTTGGTGCC-3′，下游引物为5′-CTTCCGTGCTGTAGCTGTCA-3′；BCL2上游引物为5′-GGTGAACTGGGGGAGGATTG-3′，下游引物为5′-ATCCCAGCCTCCGTTATCCT-3′；BAX上游引物为5′-AGGATGCGTCCACCAAGAAG-3′；下游引物为5′-AGCTGCCACTCGGAAAAAGA-3′；GAPDH上游引物为5′-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3′，下游引物为5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′。以2-ΔΔCt表示细胞中目的mRNA的相对表达量。

1.4 各组细胞中P-gp、BCL2、BAX、Caspase3蛋白检测 采用Western blotting法。取各组细胞，PBS洗3次，加入蛋白裂解液，置冰上裂解30 min，收集离心后取上清液，用BCA方法测定每个蛋白样品的蛋白浓度。配置SDS-PAGE凝胶，根据蛋白浓度，计算40 μg蛋白的上样体积。使用电泳仪接通电源，经过浓缩胶和分离胶，直至样品和溴酚蓝到达分离胶底部后停止电泳。使用PVDF膜200 mA转膜2 h，加入5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h，加入稀释好的一抗，4 ℃摇床孵育过夜，洗涤一抗后，在避光孵育盒中继续孵育二抗，孵育完毕后应用0dyssey激光成像系统扫描图像并检测条带灰度值，以目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值表示细胞中目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞凋亡指数比较 GES-1组、GES-1+SiRNA组细胞凋亡指数分别为3.60±0.82、4.02±0.58，两组相比，P>0.05；SGC7901组、SGC7901+SiRNA组细胞凋亡指数分别为0.36±0.05、14.98±1.01，两组相比，P<0.05；SGC7901/DDP组、SGC7901/DDP+SiRNA组细胞凋亡指数分别为0.18±0.02、12.75±0.68，两组相比，P<0.05。SGC7901/DDP+SiRNA组、SGC7901+SiRNA组细胞凋亡指数分别为12.75±0.68、14.98±1.01，两组相比，P<0.05。

2.2 各组细胞中MDR-1、BCL2、BAX mRNA相对表达量比较 GES-1组细胞中MDR-1、BCL2、BAX mRNA的相对表达量分别为0.98±0.06、1.06±0.08、1.15±0.06，GES-1+SiRNA组分别为0.92±0.05、1.02±0.05、1.06±0.05，两组相比，P均>0.05。

SGC7901组细胞中MDR-1、BCL2、BAX mRNA的相对表达量分别为1.36±0.06、1.52±0.08、0.82±0.05，SGC7901+SiRNA组分别为0.68±0.04、0.78±0.06、1.46±0.05，两组相比，P均<0.05。

SGC7901/DDP组细胞中MDR-1、BCL2、BAX mRNA的相对表达量分别为1.52±0.08、1.76±0.09、0.75±0.05，SGC7901/DDP+SiRNA组分别为0.82±0.05、1.08±0.07、1.23±0.06，两组相比，P均<0.05。

SGC7901/DDP组细胞中MDR-1 mRNA的相对表达量为1.52±0.08，SGC7901组细胞中MDR-1 mRNA的相对表达量为1.36±0.06，两组相比，P<0.05。SGC7901/DDP+SiRNA组细胞中MDR-1 mRNA的相对表达量为0.82±0.05，SGC7901+SiRNA组细胞中MDR-1 mRNA的相对表达量为0.68±0.04，两组相比，P<0.05。

2.3 各组细胞中P-gp、BCL2、BAX、Caspase3蛋白相对表达量比较 GES-1组细胞中P-gp、BCL2、BAX、Caspase3蛋白的相对表达量分别为0.78±0.05、0.58±0.03、0.46±0.04、0.36±0.03，GES-1+SiRNA组分别为0.75±0.04、0.52±0.03、0.48±0.03、0.38±0.04，两组相比，P均>0.05。

SGC7901组细胞中P-gp、BCL2、BAX、Caspase3蛋白的相对表达量分别为0.85±0.06、0.80±0.05、0.24±0.03、0.21±0.03，SGC7901+SiRNA组分别为0.45±0.05、0.62±0.05、0.48±0.04、0.40±0.04，两组相比，P均<0.05。

SGC7901/DDP组细胞中P-gp、BCL2、BAX、Caspase3蛋白的相对表达量分别为0.98±0.07、0.83±0.05、0.16±0.02、0.13±0.02，SGC7901/DDP+SiRNA组分别为0.68±0.05、0.70±0.06、0.30±0.04、0.28±0.04，两组相比，P均<0.05。

SGC7901/DDP组细胞中P-gp蛋白的相对表达量为0.98±0.07，SGC7901组细胞中P-gp蛋白的相对表达量为0.85±0.06，两组相比，P<0.05。SGC7901/DDP+SiRNA组细胞中P-gp蛋白的相对表达量为0.68±0.05，SGC7901+SiRNA组细胞中P-gp蛋白的相对表达量为0.45±0.05，两组相比，P<0.05。

3 讨论

神经酰胺是一种脂质分子，是鞘脂类的中间代谢产物，由细胞膜神经鞘磷脂水解产生，目前被认为是一种细胞内的第二信使，参与了细胞的分化、生长抑制、衰老及凋亡等多种生物学过程[7]。由GCS催化UDP-glucose上的糖基以β型糖苷键与神经酰胺相结合可以生成葡萄糖神经酰胺(glucosylceramide，GlcCer)[8]。GlcCer作为前体物质可以被细胞用来进一步合成其他鞘糖脂(glycosphingolipids,GSLs)。GlcCer不仅维持着细胞的正常结构功能，其亦与肿瘤细胞的各种生物学行为密切相关，参与了细胞的增殖分化及肿瘤细胞的MDR。近年来，越来越多的研究发现神经酰胺可以调控多种肿瘤细胞的MDR，在多药耐药的肿瘤细胞中GlcCer大量聚集，有学者认为这可以作为肿瘤细胞MDR表型的标志，肿瘤细胞可以通过调节自身细胞内神经酰胺糖基化水平导致MDR，这可能是肿瘤细胞产生MDR的一个新机制[9]。因此，我们可以通过抑制神经酰胺的糖基化，增加细胞内神经酰胺的含量来达到逆转肿瘤细胞MDR的目的。

有研究[10]发现，许多化疗药物可以通过损伤DNA或作用于凋亡相关基因来诱导细胞产生凋亡，从而发挥抗肿瘤作用，而一旦肿瘤细胞对某些化疗药物产生耐受性，就意味着肿瘤能够抵抗这些药物诱导的凋亡，因而肿瘤对这些药物产生了MDR，从而证明凋亡与MDR密切相关。近年来，越来越多的研究[11]发现，神经酰胺诱导细胞凋亡在肿瘤细胞MDR中发挥了巨大作用。殷丽等[12]使用GCS抑制剂PDMP干预K562细胞及其表柔比星耐药株K562/A02后发现，抑制GCS活性后，耐药株细胞凋亡率增加，对表柔比星的敏感性亦增加。LUCCI等[13]以阿霉素处理MCF-7及其耐药株MCF-7/AdrR两种细胞，发现阿霉素可以抑制MCF-7细胞的增殖，而MCF-7/AdrR细胞存活率没有变化，进一步研究发现耐药细胞株可以将神经酰胺转化为GlcCer，抵抗了神经酰胺诱导的凋亡。由此可见，神经酰胺可以作为第二信使介导肿瘤细胞的凋亡，MDR的肿瘤细胞可以调节自身神经酰胺及糖基化神经酰胺的比例，降低了神经酰胺的促凋亡作用，导致了肿瘤细胞MDR。

我们的研究结果显示，通过RNA干扰的方法将GCS表达抑制以后，正常胃黏膜细胞GES-1凋亡情况没有明显变化，经典的多药耐药途径MDR-1基因及其表达的蛋白P-gp亦未见明显变化。而抑制GCS表达以后，胃癌细胞SGC7901及顺铂耐药株SGC7901/DDP的凋亡指数增加，差异有统计学意义，提示GCS发挥对胃癌细胞的影响可能发生在细胞癌变以后，且SGC7901/DDP+SiRNA组凋亡指数低于SGC7901+SiRNA组，提示GCS的表达可能与胃癌细胞的MDR有关。我们进一步研究了凋亡有关的基因及蛋白的变化，发现抑制GCS表达以后，BCL2基因水平降低，BAX及Caspase3蛋白表达增加，提示GCS可能通过抑制BCL2，促进BAX、Caspase3表达而发挥抑制胃癌细胞凋亡的作用。抑制GCS表达以后，经典的多药耐药途径MDR-1基因及其表达的蛋白P-gp表达亦随之降低，但耐药细胞株的表达高于普通胃癌细胞株，提示GCS可能通过经典的MDR途径影响了细胞的MDR。

综上所述，抑制GCS的表达，可以促进胃癌细胞及其耐药株凋亡，其作用机制可能与调节凋亡通路中的关键分子比如BCL2、BAX及Caspase3等有关。GCS的表达亦与胃癌细胞的MDR有关，其可能通过经典的MDR-1通路影响胃癌的MDR。GCS可能是改变胃癌MDR、提高胃癌化疗效果的潜在靶点。