纳米探针应用研究进展及其对结肠癌诊治的应用进展

刘志超，卢波君，杨 炯，屈亚威 综述 刘海峰 审校

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一[1]，在国内，据调查其发病率呈逐年增高，每年新发病例约140万例[2]。最新不完全统计数据显示，至今美国2020年结直肠癌全年发病人数接近15万人，占总癌症发病人数的9%，死亡的9%，仅次于肺癌、前列腺癌、白血病，已成为癌症中的第四大杀手[3]。

早期结肠癌手术后5年存活率可高达90%，而晚期存活率仅为17%[4]。因此，结肠癌的早期诊断与治疗对于结肠癌的预后非常重要[5]。目前，纤维结肠镜仍然是结肠癌早期诊断的金标准[6]，但受操作医师技能的限制及结肠生理弯曲等因素，往往存在一定的漏诊[7]。常规手术不能有效提高患者生存率[8]，而放射治疗、化学药物治疗在杀死癌细胞时，会给人体正常细胞也带来严重损伤，极大地降低了癌症患者的生存质量[9]。纳米探针技术在材料、生物、医药等领域的急速发展为我们更加精准、高效、低毒地诊断和治疗癌症提供了广阔的思路。笔者综述纳米探针技术在结肠癌诊断和治疗领域的研究进展，并展望其应用前景。

1 应用研究进展

纳米探针是一种能探测单个活细胞的新型超微生物传感器，具有体积小(1～100 nm)、能在细胞内实时测量、对细胞无损伤或微损伤等诸多特点，通过将药物和成像试剂与纳米探针有机结合，可以将药物和成像剂精确地递送到病变组织，达到有效治疗癌症、减少药物毒副反应的目的[10,11]。自1960年全球首次报道脂质体作为蛋白和药物载体以来，控释聚合物、聚乙二醇化的脂质体、聚合物胶束、树枝状聚合物等众多的纳米材料被应用于疾病的诊断和治疗[12]。

随着研究的发展，发现无机纳米材料，例如，量子点探针[13]、不同结构的纳米金[14,15]、碳纳米材料[16]、磁性纳米颗粒、钯纳米片[17]、硫化铜纳米材料[18]和其他新型纳米材料[19,20],这些材料具有较高的对比度、稳定性和生物兼容性，可以实时动态成像，为癌症的诊断和治疗评价提供影像支持。前些年，无机探针在体内的潜在毒性与降解问题得不到有效的解决。近几年，有机纳米探针如有机近红外染料[21]、卟啉脂质体[22]和高分子聚合物因在生物安全性方面具有明显优势而得到研究者们的广泛关注，例如，NIR染料探针可随尿液代谢出体外；基于蛋白质、脂质体、聚多巴胺等物质的光热探针可在体内完全降解；聚苯胺、聚吡咯等光热探针虽然不易降解，但也不会溶解并释放出有毒元素[23]，因结构稳定性和光稳定性好而被用于光热治疗；部分聚合物材料具有良好的应用前景，但仍需要解决一些问题。

据不完全统计，截至2010年前已经有24种基于脂质体、聚合物、白蛋白和纳米晶种材料开发的纳米制剂被批准并应用于临床。如：美国先灵葆雅公司生产Doxil/Caelyx(阿霉素-脂质体)可用于治疗乳腺癌、卵巢和卡博西肉瘤 可用于治疗乳腺癌、卵巢和卡博西肉瘤；美国阿斯利康公司制造并在2014年获批上市的 Abraxane(紫杉醇-白蛋白混悬剂[24])成功用于治疗晚期乳腺癌。纳米探针不仅大大提高了抗癌药物的肿瘤靶向作用，还显著减少了传统剂型中使用辅料以及高浓度下化疗药物本身所产生的毒副作用，多个地区及国家的临床治疗结果也显示出其相比于传统溶剂化疗，探针包裹的肿瘤治疗效果更好。

我国用于癌症治疗的创新的纳米药物在全国来说仍属于产业空白，相比于美国日本等地起步较晚。江苏恒瑞首仿的注射用紫杉醇(白蛋结合型)已获得优先审评；国内的研究团队在可降解聚合物纳米胶束、脂质体包裹ICG 探针和DOX药物复合纳米颗粒制备上也已取得突破性进展，正在筹备审批用于临床治疗。利用纳米探针技术精准及高效能地诊断和治疗癌症已成为可能，下一步研究的重点方向将是开发更加安全的纳米级探针。

2 对结肠癌的诊断应用

传统的生物医学成像技术，如X线成像、超声成像、核磁共振成像、计算机辅助层析等，对癌症的早期检测效果欠佳。目前，结肠镜检查是结肠癌诊断的主要方法，如白光内镜、染色内镜等，但单纯直观镜检难以在结肠癌早期灵敏、精准地诊断，而探针与镜检相结合可对人体内部生理或病理过程实现动态成像，从而对肿瘤进行更早、更有效地诊断[25]。

2.1 酶活化探针 酶的生物相容性强，表面的活性基团便于功能性修饰，因此，酶活化探针可以无创、实时、高特异性、高灵敏度地进行肿瘤病灶检测。近年来人们发现某些近红外光谱(NIR)染料与蛋白质之间存在共价或非共价相互作用[26]，从而探索以普通蛋白和酶负载NIR染料作为荧光探针来识别和定位结肠肿瘤细胞。Mitsunaga等[27]研究发现，γ-谷氨酰转肽酶在结肠肿瘤细胞中高表达，可催化酶活化探针发出荧光，小动物活体实验显示，局部喷洒探针后5 min可探查到直径<1 mm的结肠肿瘤病灶。余祖红等[28]利用肿瘤的标志物基质金属蛋白酶(MMPs)[29]特异性识别多肽底物的特性，设计和构建了分别将荧光素(FITC-N3)和荧光淬灭基团Dabcyl-NHS偶联于多肽底物两端，制备得到MMP-2/9特异性识别的荧光能量共振转移(FRET)荧光分子探针Dab-GPLGVRGYFITC，将其成功应用于人源大肠癌细胞LoVo和临床结肠癌组织样本体外检测初步研究，充分证明了探针对MMP-2/9检测具有较强的特异性和灵敏度，检测率高达95%以上。该探针与组织结肠癌裂解液作用后荧光信号比胃炎组织强5到9倍，因此对结肠癌早期临床诊断具有极大潜力。

2.2 金纳米探针 金纳米(gold nanorods，GNRs)是将含金的金属盐合成球状、棒状及星形等多种形态、具有不同性质属性的纳米颗粒(直径1～100 nm)。GNRs具有显著的表面等离子共振(LSPR)特性、制备过程简单、生物相容性和稳定性好，被广泛应用于生物成像和治疗中[30]。

Lin等[31]使用金纳米颗粒作为表面增强拉曼光谱(SERS)[32,33]的探针，可动态地获得结肠癌患者的血清生物化学信息。该方法的PCA-LDA(主成分分析-费希尔线性判别分析)诊断算法诊断结肠癌的敏感性和特异性分别为97.4%、100%，结果表明以金纳米颗粒作为探针的表面增强拉曼光谱联合PCA-LDA 对结肠癌的检查具有极高的化学特异性、敏感性和分辨率，如果在今后的研究中，能够克服扫描速度相对缓慢、光谱的信号较弱等限制因素，该方法会变得更加完善。

Huang等[34]利用Stober法将金纳米棒表面的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)替换成硅壳层，颗粒表面修饰叶酸，合成了具有高效CT成像和光热治疗能力的多功能金纳米诊疗体系(GNR-SiO2-FA)。金纳米/银纳米的SERS以及局部表面等离子共振效应性质使其能够高效地区分骨骼和其他组织，再结合光热/光动力治疗，易于实现金纳米/银纳米的诊疗一体化[35]。

2.3 SERS免疫探针 席刚琴等[36]将制备的SERS探针与癌胚抗原(CEA，是唯一推荐用于结肠癌患者常规临床检测的分子标志物[37])单克隆抗体结合形成SERS免疫探针，将SERS探针与结肠癌组织切片上的相应的抗原发生特异性结合后进行SERS检测和成像，结果显示CEA在结肠癌腺上皮高表达，在间质及正常上皮基本不表达。该结果表明，SERS标记抗体检测分析技术具有高敏感性和高特异性，有望应用于结肠癌组织切片中蛋白质表达的分析，成为结肠癌辅助诊断的一种重要方法。

2.4 抗原特异性结合探针 Sakuma等[38]研究中设计能与结肠癌组织TF(Thomsen-Friedenreich)抗原特异结合的探针，并将其局部应用到鼠原位结肠癌模型中，分别用白光内镜及荧光内镜成像，TF抗原在结肠癌组织中高表达，而在正常结肠组织中几乎不表达，显示出较好的特异性。结果显示，荧光内镜能发现传统内镜不易发现的病变，且可以检测化疗过程中TF表达的动态改变。

2.5 表皮生长因子受体特异性结合探针 Liu等[39]局部应用能特异结合EGFR(表皮生长因子受体)的荧光分子探针后，CLE局部成像，结果显示，在37 例活体分子成像中，在结肠癌、结肠腺瘤患者检测到荧光信号的比例分别为18/19、12/18，而在10 例正常黏膜处几乎没有或仅有很微弱的荧光信号。肿瘤组织的微循环以扩张、扭曲、囊性血管网的形成为特点，因此，对肿瘤血管的成像并确定其形态特征，是实现优化肿瘤靶向血管治疗即抗血管生成疗法目标的前提之一。

2.6 循环肿瘤细胞分子探针 肿瘤细胞突破细胞基底膜进入人体血液形成了循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)，是肿瘤逐步发展的重要标志，是肿瘤形成并转移的早期状况。与超声、影像和穿刺等辅助检查相比，外周血CTC检测简便、无创，能直观、实时监测肿瘤进展。研制CTC分子探针是实现对实体瘤早期诊断的基础[40]。国内庞代文团队制备了EpCAM单抗修饰磁性纳米粒子，实现了全血样品中CTC的快速捕获和检测，已用于结肠癌除病理外的临床检测指导用药中[41]。

2.7 上转换纳米粒子(UCNPs)探针 上转换纳米粒子(up-conversion nan-oparticles，UCNPs)具备抗光、发光稳定性良好，生物安全性高，易与抗体耦联等的优点。曹永等[42]采用热解法制备CD44v6功能化UCNPs探针，并将其用于体外结直肠癌肿瘤干细胞的荧光成像，为结直肠癌的早期诊断及治疗提供实验性理论基础。

3 对结肠癌的治疗应用

3.1 纳米探针通过光动力疗法治疗 骆莉萍等[43]利用光敏剂诱导的光动力疗法(PDT)[44]，评价血卟啉衍生物(HPD)和5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)两种光敏剂对结直肠癌的治疗效果，研究者们将120例晚期结直肠癌患者，随机分成两组，观察组和对照组均采用常规化疗，观察组联合PDT进行治疗，周期3个月，结果，观察组症状改善率、总有效率、中位生存时间均明显高于对照组，并有统计学意义，从而证明用5-ALA生物诱导的光动力疗法可有效缓解结肠癌患者的症状，延长生存期。

3.2 纳米染色标记辅助内镜下手术 据报道，结肠癌术后伴淋巴结转移可能性高达45%以上，因此，傅骏等[45]探索向癌灶周围注入钠米碳染色标记，而后再行根治术，通过随机对照发现，钠米碳淋巴结示踪剂染色效果良好，标记组淋巴结检出数明显高于对照组，转移淋巴结检出率和黑染淋巴结阳性转移率均高于对照组。因此，能有效指导与定位结肠癌手术，正确制定手术方案并实施淋巴结清除术。

3.3 纳米基因载体诱导结肠癌细胞凋亡 余丽[46]通过两步接枝共聚法制备出粒径较小、粒度分布均匀的RNA纳米颗粒，选取人基因序列中的相关位点序列构建靶向的重组质粒，筛选出最佳的重组质粒载体，将新型壳聚糖聚乙二醇纳米基因载体导入结肠癌细胞，评价纳米基因载体对结肠癌的抑制和凋亡效果，结果显示，壳聚糖聚乙二醇纳米颗粒其细胞毒性低、转染率高，能够高效转染结肠癌细胞株并有效干扰，诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖。其能长时间高效介导干扰沉默结肠癌细胞中的基因表达。

3.4 立体复合胶束对结肠癌的治疗 沈可欣[47]成功应用纳米技术合成制备聚乳酸立体复合胶束，并以环状 RGD 多肽作为靶向配体基团修饰纳米胶束，然后成功将化疗药阿霉素(DOX)装载其中作为纳米探针负载抗肿瘤药物。最后验证了纳米胶束载体SCM/DOX及 cRGD-SCM/DOX能够提高肿瘤细胞对药物的摄取，确定了其在结肠癌治疗中的靶向作用，达到杀伤消灭结肠癌细胞的效果。

综上所述，现在国内已有不少优秀的科研团队和企业在从事商品化纳米探针的研发，并已初见成效，随着纳米技术在医药、生物、化学、材料、工程等多领域、多学科的迅猛发展，不同材料、不同结构整合于一体的多功能化纳米颗粒将被制成探针，能够研发出进一步降低生物毒性、增加稳定性和个体相容性的产业化纳米探针。将来，纳米探针技术会向集传输药物、靶向跟踪、分子影像学诊断、光热治疗、药物控释等功能于一体的方向发展，最终实现纳米探针在肿瘤诊疗一体化领域的广泛应用。