不同消毒药物对断奶羔羊舍空气中大肠杆菌的杀菌效果研究

许国洋，付利芝，徐登峰，张素辉

（重庆市畜牧科学院，重庆市兽用生物制品工程技术研究中心，重庆 荣昌 402460）

大量临床数据表明，大肠杆菌引发的羔羊腹泻是养羊场的一种常见疾病［1］，本研究围绕常规消毒药物对大肠杆菌的消毒效果进行分析，针对性解决断奶羔羊腹泻常发的难题，为防控大肠杆菌性羔羊腹泻提供数据支撑，也为羊舍临床消毒药物的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 培养基及消毒药物 选用麦康凯琼脂培养基对空气中的大肠杆菌进行分离培养和计数。选择的消毒药物为聚维酮碘、戊二醛、苯扎溴铵。参照许国洋等［2］的方法设计合成细菌通用引物，引物序列信息为F：5′-AGAGTTTGATCCTGCTCAG-3′，R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 大肠杆菌的分离鉴定 利用麦康凯琼脂培养基对断奶羔羊舍内空气中的大肠杆菌进行分离培养，经革兰氏染色镜检观察，并通过细菌通用引物F/R 扩增分离菌的16S rRNA 基因序列，PCR 产物送生工生物工程有限公司进行测序分析。

1.3 药物敏感性分析 将直径为6 mm的空白圆形滤纸片于121 ℃高压灭菌15 min，烘干备用。将处理好的空白纸片置于含有消毒药物的西林瓶中，12 h后取出，37 ℃烘干备用。采用常规纸片琼脂扩散法（K-B），检测分离到的大肠杆菌对不同药物的敏感性。测得的抑菌圈直径＜10 mm，表示对药物不敏感，抑菌圈直径在10～15 mm 表示对药物中度敏感，抑菌圈直径＞15 mm 表示对药物高度敏感。

1.4 羊舍空气中的细菌检测 采用自然沉降法检测消毒前后羊舍空气中的大肠杆菌数量变化。将各培养基暴露于空气中5 min，置于37 ℃恒温培养箱中培养，24 h 后对平板中的微生物进行计数。所有检测数据均使用SPSS 2.0 统计分析。

舍内空气中菌落数的计算公式为：细菌数（CFU/m3）＝N×100/A×5/T×1 000/10＝50 000N/AT。式中，A为平板面积（cm2），T为平板暴露时间（min），N为平板平均菌落数（CFU）。

2 结果

2.1 大肠杆菌的分离鉴定 通过对断奶羔羊舍内空气中大肠杆菌的分离鉴定，获得1株革兰氏阴性短杆菌。利用细菌通用引物，在1 500 bp 位置扩增出单一条带，测序结果表明其大小为1 468 bp，见图1。在NCBI 中比对分析，发现其与大肠杆菌（NCBI 登录号：NR_024570.1）的同源性最高（达99%）。

图1 16S rDNA PCR扩增产物

2.2 药敏试验结果 通过测定大肠杆菌对不同药物的敏感性，发现其对苯扎溴铵高度敏感，抑菌圈直径达21 mm，与聚维酮碘和戊二醛差异极显著（P＜0.01）。详见表1。

表1 药敏试验结果

2.3 消毒前后大肠杆菌总数测定分析 通过对消毒前后舍内空气中大肠杆菌的统计分析，发现消毒前后各圈舍空气中的大肠杆菌数均发生变化，结果见表2。

2.4 消毒效果分析 通过对消毒前后各组大肠杆菌数量的变化分析，发现消毒后聚维酮碘组与苯扎溴铵组的大肠杆菌数均减少，戊二醛组和对照组升高。其中，苯扎溴铵组与戊二醛组、对照组差异极显著（P＜0.01），与聚维酮碘组差异显著（P＜0.05）；聚维酮碘组与戊二醛组、对照组差异极显著（P＜0.01），戊二醛组与对照组差异不显著（P＞0.05）。详见图2。

表2 消毒前后大肠杆菌数统计结果

图2 消毒前后大肠杆菌数量变化

3 讨论

当前，羊群的集中化管理给疫病的传播创造了良好条件，因此，环境消毒尤为重要［3］。腹泻是一种胃肠道性疫病，病原菌感染是其主要病因。随着养羊业的发展，大肠杆菌诱发的羔羊腹泻问题日益严重［4］。大肠杆菌具有多个血清型，存在区域性差异，且易产生耐药性，因此，开展针对断奶期羔羊腹泻的研究十分必要［3］。

沉降法检测出的环境微生物数量，可以客观地反应空气污染的程度和卫生通风情况，是判断空气污染的指标之一，也是评判空气消毒除菌效果的重要指标。本研究发现苯扎溴铵与聚维酮碘的杀菌效果明显，经其消毒后空气中大肠杆菌的含量均下降，其中又以苯扎溴铵的消毒效果最好。综合考虑药物的消毒效果和舍饲山羊的发病情况，建议对羊场消毒程序作优化改进，推荐使用聚维酮碘和苯扎溴铵轮换对断奶羔羊舍进行舍内消毒。