复配菌对含蜡原油含蜡量及其黏度作用分析

孟凡怡，杜胜男，冯宪明，王 超，王卫强

（1.辽宁石油化工大学 石油天然气工程学院，辽宁抚顺113001；2.中油（新疆）石油工程有限公司 设计分公司，新疆 克拉玛依834000）

在含蜡原油的管输过程中，当温度低于含蜡原油析蜡点时，蜡晶逐渐析出并沉积在管壁处，形成蜡沉积[1]。蜡的沉积会使蜡晶成块状聚集，蜡分子之间形成较强的空间网状结构，使原油黏度增加[2]。并且，蜡沉积使管道流通面积减小，增加油流摩擦阻力，降低管道输送效率，严重时甚至会发生凝管事故[3]。因此，解决含蜡原油蜡沉积问题，提高含蜡原油运输效率，保障含蜡原油的流动，是油气行业关注的重要问题。

传统的除蜡方法，包括热处理、清管和化学除蜡都存在一定的缺陷[4-5]。与传统的除蜡方法相比，微生物清防蜡方法具有易于操作、环保、低毒性和可持续发展等特点[6-7]。M.H.Joo 等[8]将实验室已有菌种枯草芽孢杆菌用于原油除蜡，结果表明，在经过枯草芽孢杆菌JK-1 处理的原油中，C1—C29 碳链在48 h 内几乎完全降解。N.Sakthipriya 等[9]从印度古吉拉特邦油田中筛选出一株枯草芽孢杆菌，在37 ℃的条件下使含蜡原油黏度降低了60.00%，在50 ℃条件下使含蜡原油黏度降低了82.00%。结果表明，该菌株对热带气候国家原油的降黏效果非常明显。A.Daryasafar 等[10]从伊朗油田中筛选出一株地衣芽孢杆菌并进行了实验，该菌株能够产生生物表面活性剂，结果表明含蜡原油黏度降低了41.24%。C.Luo 等[11]发现假单胞菌DG2 并进行了实验，结果表明该菌可以产生脂肽类生物表面活性剂，并且能够乳化原油，降低油水界面张力，使原油黏度降低了23.00%，有效地提高了原油流动性。上述研究结果表明，微生物可以降解烷烃，产生的生物表面活性剂对原油有乳化作用，可降低油水界面张力，提高含蜡原油流动性。

在微生物清防蜡技术的发展过程中，筛选出能够高效降解原油中烷烃的菌株是该技术发展的关键。目前，研究重点大多放在单一菌种降解烷烃并提高原油流动性方面，对复配菌提高原油流动性方面的研究不够成熟。本文利用微生物之间产生的协同效应，对两株实验室已有菌种枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞杆菌进行混合培养。结果表明，复配菌对改善含蜡原油流动性、提高管输效率、保障含蜡原油管道输送安全等方面具有较好的应用前景。

1 实验部分

1.1 菌种来源、实验油样、试剂及仪器

1.1.1 菌种来源 以石蜡为唯一碳源，从大庆油田受石油长期污染的土壤中筛选出枯草芽孢杆菌6#（菌株6#）及铜绿假单胞菌3#（菌株3#）。

1.1.2 实验油样 实验油样采自大庆油田，37 ℃下原油的黏度为1 267 mPa·s，油样中蜡质量分数为0.45%。

1.1.3 试剂 K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、(NH4)2SO4、脲素、NaNO3、MnSO4、ZnSO4、CuSO4·5H2O、CoCl2、H3BO4、NaMoO4，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，质量分数均大于等于99.0%；液体石蜡（分析纯，其相对密度为0.830～0.860）、FeSO4·xH2O（Fe 质 量 分 数 为21.0%～23.0%）、CaCl2·H2O（分析纯，质量分数大于96.0%），国药集团化学试剂有限公司。

1.1.4 仪器 LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；HZQ-C 空气浴振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；BHC-1300IIA/B2 型生物洁净安全柜，上海苏净实业有限公司；UV-2550 紫外分光光度计，上海科恒实业发展有限公司；H3-20K 台式高速离心机，湖南可成仪器设备有限公司；LORTEX-5 涡旋振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；JJ2000B 旋转滴界面张力测量仪，上海中晨数字设备有限公司；Q2000 DSC 差示量热扫描仪，美国TA 公司；BX-51 偏光显微镜，日本奥林巴斯有限公司；HAKKE 流变仪，上海珩璟科技有限公司；JJ124BF 高精度电子分析天平，常熟市双杰测试仪器厂；LGR201D 旋转蒸发器，郑州世联良工仪器设备有限责任公司。

1.2 菌株复配条件的优化实验

（1）研究菌株的最佳复配比。将产表面活性剂菌株——菌株6#与除蜡菌株——菌株3#按3∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2、1∶3 的体积比复配，以体积分数5%的接种量接种于100 mL 无机盐培养基中震荡培养，通过紫外分光光度计在波长为600 nm 的条件下测定菌液光密度（OD 值），并根据菌液光密度判定最佳混合比例。

（2）研究菌种最佳生长温度。将菌液以体积分数5%的接种量接种于无机盐培养基中，在31、34、37、40、43 ℃的条件下振荡培养。

（3）研究菌种的pH 适应范围。用NaOH 和HCl调节无机盐培养基的pH（4～9）。

（4）测定矿化度适应范围。用NaCl 配置Na＋质量分数分别为0、1%、2%、3%、4%的5 个梯度的无机盐培养基。

1.3 排油圈实验

取一个直径为15 cm 的无菌洁净平板，向平板中倒入80 mL 的无菌纯水，再向平板中加入1 mL 经油红染色的液体石蜡，液体石蜡在水面上形成一层薄油膜[11]。将菌株发酵液用高速离心机离心去除菌体，取0.1 mL 无细胞上清液滴入油膜中心，观察油红的扩散现象。

1.4 乳化实验

将2 mL 液体石蜡与等量的无细胞上清液加入到离心管中，高速涡旋2 min，并使其在室温下静置24 h。，测量乳化层高度及油层总高度，乳化层高度及油层总高度取3 组实验的平均值，根据式（1）计算乳化指数[12]。

式中，E24为乳化指数，%；Eh为乳化层高度，cm；Th为油层总高度，cm。

1.5 发酵液表面张力的测定

将发酵培养7 d 后的菌株发酵液用高速离心机离心去除菌体，得到无细胞上清液，通过界面张力仪测定不同菌株发酵液的表面张力。进行3 组平行实验，表面张力取3 组实验的平均值。

1.6 菌株降解性能的测定

将体积分数为5%的发酵液注入含12 g 蜡质原油的200 mL 无机盐培养基中，同时增设无菌对照组，在37 ℃的温度下震荡培养7 d。7 d 后，添加50 mL 正己烷回收残余原油。重复萃取3 次，混合萃取液。混合液用无水硫酸钠脱水4 h[13]。然后，用旋转蒸发器在40 ℃蒸发。残余物质量采用高精度电子分析天平称重。通过式（2）计算生物降解率[14]。进行3 组平行实验，原油的初始质量、残留原油的质量及对照组原油的蒸发和自然降解质量取平均值。

式中，Mx为原油的初始质量，g；My为残留原油的质量，g；Me为对照组原油蒸发和自然降解质量，g。

1.7 菌株对含蜡原油蜡晶形态的影响

在37 ℃、200 倍放大倍数下，使用偏光显微镜观察经菌株处理后的蜡晶结构变化。

1.8 菌株对含蜡原油蜡组分的影响

经复配菌处理前后原油中蜡组分的质量分数、析蜡点和析蜡高峰点，使用DSC 进行测定。根据式（3）计算原油蜡质量分数[15]。

式中，Tc为样品DSC 曲线偏离基线温度，℃；dQ 为在［－20，Tc］的时间段蜡晶放出的热量，J/g；Q 为蜡晶平均释放热量，本文取210 J/g。

1.9 菌株对含蜡原油表观黏度的影响

将12 g 大庆含蜡原油加入菌液体积分数为5%的200 mL 无机盐培养基中，同时增设无菌对照组，在37 ℃的温度下震荡培养。7 d 后，通过HAAKE流变仪分别测定经菌株6#、菌株3#和复配菌株处理前后的原油黏度。

2 结果分析

2.1 菌株最佳生长条件

单一菌株及复配菌株的生长特性曲线如图1 所示。由图1 可知，菌株6#与菌株3#的复配体积比为3∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3 时，复配菌株活性随着菌株3#在复配菌中所占份额的增加而升高，而且在菌株6#与菌株3#的复配体积比为2∶3 时，复配菌株活性最高；菌株6#与菌株3#的复配体积比为1∶2、1∶3 时，复配菌株活性随着菌株3#在复配菌株中所占份额的增加而下降；在菌株6#与菌株3#的复配体积比为1∶3时，复配菌活性低于单一菌株6#和菌株3#。为保证得到最佳作用效果，菌株6#与菌株3#的最佳复配体积比为2∶3。

温度通过细胞中生物酶的活性影响细菌的生长，只有适合的温度才能使菌种具有最佳的生长活性[16]。不同温度下复配菌株的生长特性曲线如图2 所示。由图2 可知，当温度为31～37 ℃时，复配菌株的生长速度和活性与温度呈线性关系。但是，当温度过高时，菌株活性发生剧烈波动，当温度为43 ℃时，菌株生长遭到严重抑制。对比分析该复配菌株在不同温度下的生长特性曲线发现，该混合菌株在37 ℃的温度下活性最高，因此选择37 ℃为最佳培养温度。

pH 影响细胞膜通透性和蛋白活性，进而影响菌株的生长和代谢[17]。不同pH 下复配菌株的生长特性曲线如图3 所示。

由图3 可知，在pH 为4～7 时，随着pH 的增加，复配菌株的生长速度加快，活性提高；当pH 为7 时，该复配菌株活性达到最大。实验结果与S.Yan 等[18]的研究结果相同。继续提高培养基的pH，菌株活性波动剧烈，当培养基的pH 为9 时，菌株生长明显遭到抑制。因此，培养基的最佳pH 为7。

矿化度即Na+质量分数影响细菌细胞的渗透压，从而影响细菌的生长[19]。不同Na+质量分数下复配菌株生长特性曲线见图4。由图4 可以看出，Na+质量分数为1%时菌株活性高，当培养基Na+质量分数达到4%时，菌株活性明显遭到抑制。对比分析该复配菌株在不同Na+质量分数下的生长曲线发现，该复配菌株的最佳Na+质量分数为1%。

2.2 排油圈实验

微生物在利用烃类物质生长代谢时会产生生物表面活性剂，这种表面活性剂分子集亲水基团与亲油基团为一体，在具有亲水性的同时也具有疏水性[20]。排油圈法可以对生物表面活性剂进行定性分析[21]。菌株在发酵过程中产生的生物表面活性剂的浓度与排油圈直径呈正相关[22]。排油圈实验结果如图5 所示。由图5 可以看出，菌株6#的排油圈直径明显小于复配菌株的排油圈直径。这是因为菌株3#与菌株6#混合后，菌株3#可以将长链烃有效地降解为短链烃，短链烃相较于长链烃更容易被利用。因此，菌株6#可以更好地利用培养基中的短链烷烃产生生物表面活性剂。

2.3 乳化指数（E24）与表面张力（ST）的测定

乳化指数与菌株产生的生物表面活性剂的乳化特性密切相关，乳化指数越高，其乳化能力越强[23]。菌株乳化指数和表面张力的评价效果见表1。

表1 菌株乳化指数和表面张力的评价效果

由表1 可知，复配菌株对液体石蜡的乳化效果最明显，乳化指数达到（55.39±0.13）%；菌株6#的乳化指数为（37.38±0.08）%，明显低于复配菌株的乳化指数，菌株3#的乳化指数极低，只有（3.75±0.13）%。对比分析可以看出，菌株6#与菌株3#复配可以更好地乳化不溶性烃类底物。菌株3#将难以利用的长链烃降解为短链，菌株6#进一步利用短链烃，产生大量的生物表面活性剂。表面活性物质可以乳化原油，提高烃类的溶解度，间接地提高了生物利用率，使菌株3#可以更好地利用烷烃[24]。

表面活性物质不仅可以乳化原油，也可以降低原油的表面张力[25]。表面张力的降低有助于油水两相的混合，提高微生物对石蜡的降解率。原油中含蜡量降低，使原油黏度降低，提高含蜡原油流动性，进而提高原油管输效率。接种复配菌株的培养基表面张力的降低幅度明显高于单菌，表面张力降低到（38.83±0.07）mN/m，降 低 了（41.06±0.18）mN/m。这一现象更加充分地证明了菌株6#和菌株3#之间具有协同促进作用，印证了乳化活性和排油圈试验结果。

2.4 复配菌株对含蜡原油的降解作用

菌株对含蜡原油的生物降解效果见表2。由表2 可以看出，菌株6#、菌株3#和复配菌株均能够降解含蜡原油。其中，复配菌株降解7 d 后的残余原油质量明显小于初始量，经计算得到复配菌株的生物降解率为（52.66±0.13）%。该结果表明，复配菌株可以更好地利用含蜡原油中的烃类，将其降解为低分子化合物，并且部分烃类被完全降解为水和二氧化碳[26]，其结果可以显著降低原油黏度。

表2 菌株对含蜡原油的生物降解效果

2.5 复配菌株对含蜡原油除蜡作用分析

菌株对析蜡点、析蜡高峰点、蜡质量分数和除蜡率的影响见表3。由表3 可知，菌株3#和复配菌株对含蜡原油的除蜡率分别为43.28%和51.64%；经菌株3#处理后，含蜡原油的析蜡点为46.47 ℃，析蜡高峰点为24.34 ℃；经复配菌株处理后，含蜡原油析蜡点为44.98 ℃，析蜡高峰点为22.47 ℃。这一结果说明，与菌株3#相比，复配菌株能更显著地改变含蜡原油中蜡质量分数、析蜡点和析蜡高峰点。降低原油的蜡质量分数，可以减少蜡沉积，析蜡点及析蜡高峰点的降低有利于抑制蜡晶组分的析出，达到清防蜡的目的，进而降低原油黏度，提高含蜡原油的流动性。这一结果从宏观上表明复配菌株对含蜡原油的除蜡作用更为明显。

表3 菌株对析蜡点、析蜡高峰点、蜡质量分数和除蜡率的影响

2.6 复配菌株对含蜡原油蜡晶形态的影响

菌株处理前后的蜡晶结构如图6 所示。从图6可以看出，未经复配菌株处理的含蜡原油中蜡晶直径大，且呈块状聚集，分布密集，同时小粒径蜡晶有向大块蜡晶聚集的趋势；经复配菌株处理后，含蜡原油中的蜡晶分布由密集变为稀疏，蜡晶直径明显变小。实验结果与罗超等[27]的研究结果相同。含蜡原油中的蜡晶经复配菌株降解后，其结构形态以及分布均发生了变化，在一定程度上可抑制蜡沉积现象，有助于降低原油黏度，提高含蜡原油的流动性。

2.7 复配菌株对含蜡原油表观黏度的影响

在含蜡原油的管输过程中，黏度是决定原油输送难易程度的一个重要指标[28]。菌株处理前后含蜡原油的表观黏度变化曲线如图7 所示。

由图7 可知，复配菌株对含蜡原油表观黏度的影响明显大于菌株6#和菌株3#。经计算可知，在37 ℃的条件下，经菌株6#和菌株3#处理的含蜡原油表观黏度的降低率分别为42.20%和14.74%；经复配菌株处理的含蜡原油表观黏度的降低率为64.72%。该结果优于王卫强等[29]的纤维微菌属与假单孢菌的复配菌株对原油的降黏效果。其原因是：①复配菌株将含蜡原油中的高分子量烷烃降解为更易被微生物利用的低分子量烷烃，使含蜡原油黏度降低[30-32]；②复配菌株降解烃类产生的代谢产物可以增溶或乳化原油，降低油水界面张力，进一步提高不溶性烃类的利用率，改善原油流动性[33]；③微生物在降解过程中产生的大量的酸、醇等有机溶剂，也有助于降低原油黏度，进一步改善原油流动性。

3 结 论

对从大庆石油污土中筛选出的菌株6#（产表面活性剂菌种）和菌株3#（嗜蜡菌）进行复配，优化得出其最佳复配体积比为2∶3，最佳培养温度为37 ℃，最佳培养pH=7，最佳培养Na+质量分数为1%；对液体石蜡的乳化效果高达55.39%，液体石蜡培养基的表面张力从（79.89±0.11）mN/m 降低至（38.83±0.07）mN/m；将复配菌株以体积分数5%的接种量与含蜡原油作用7 d，7 d 后测得含蜡原油表观黏度降低了64.72%，原油含蜡量降低了51.64%，原油的生物降解率为(52.66±0.13)%。与单一菌株相比，复配菌株在含蜡原油除蜡降黏和提高原油流动性能方面更具优势,因此未来应重点关注多菌种的复配问题，探寻更为有效的微生物复配菌株。