新型猪瘟耐热活疫苗冻干工艺设计分析

2020-12-29么亮

兽医导刊 2020年16期

么亮

（华威特（江苏）生物制药有限公司，江苏泰州 225300）

0 引言

猪瘟是一种由CSFV病毒引发的高度接触性传染病，被我国列为一类动物疫病，对于养猪业发展构成严重威胁。当前市场现有猪瘟活疫苗对于冷链环境、保护剂及干燥工艺的要求较高，且耐热性能较差、存在一定副作用、无法实现批量化生产，对于活疫苗工艺规律的改进与优化提出了现实需求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验材料选取TB公司生产的猪瘟兔化弱毒株与ST细胞，日龄为90～110d的健康种兔，20日龄仔猪，J研究所研发的猪瘟耐热配方，以及S公司生产的dmem培养基、C5H8NNaO4等试剂。试验仪器选用0.15㎡、0.5㎡和2㎡三种规格的冷冻真空干燥机，恒温干燥箱（温度分别为37℃和45℃），荧光显微镜，FDCS196低温冻干显微镜，以及DSC热分析仪。

1.2 试验参数测定

选用DSC热分析仪针对毒株与猪瘟耐热配方混合溶液进行测定，测得混合液升温速率为10℃/min，由初始温度上升至30℃，温差为80℃。选用FDCS196低温冻干显微镜进行混合液测定，测得初始温度、最终温度分别为18℃和-45℃，降温速率达到每秒0.3℃，真空度为20Pa。

1.3 冻干程序

在冻干程序设计上分为三个环节：在预冻环节，将隔板温度设为4℃、-42℃、-42℃，对应的时间分别为60min、120min、150min，预冻方式均为H，真空度不计；在一次干燥环节，将隔板温度分别设为-10℃、4℃和20℃，在R条件下对应的时间分别为30min、30min和120min，与H对应的时间分别为600min、200min和150min，真空度均为100Pa；在二次干燥环节，将隔板温度设为28℃，与H对应的时间为200min，真空度不计。其中H为快速降温/升温至预设温度后维持一段时间；R为设定时间内慢速降温/升温至预设温度[1]。取冻形合格、残水率≤3%的样品，置于37℃环境下保存10d，完成耐老化试验和间接免疫荧光法检测，确保病毒滴度下降之差≯1Lg，并基于RID方法完成复核。在此基础上，选用0.15㎡、0.5㎡和2㎡三种规格的冻干机进行逐级放大，完成工艺放大处理。

1.4 疫苗性能检测

选取耐热性、安全性两项指标进行活疫苗性能检测，选取活疫苗依据三个批次置于37℃、45℃两种温度环境下进行保存，测定疫苗的TCID50/ml指标，并将其与商品苗进行比较，判断耐热效果；同时选用生理盐水分别配制出10头份/ml、20头份/ml、30头份/ml的疫苗，以1ml/头的剂量对10头仔猪进行肌肉注射，并配置未注射疫苗的对照组，结合免疫后仔猪的临床表现判断疫苗的安全性能。

2 结果与分析

2.1 试验参数测定结果

通过观察猪瘟耐热配方混合液的测定结果可以发现，混合液的共晶点为-26.5℃，塌陷温度为-22.5～-20.5℃。将其与冻干工艺相结合，预冻温度约为16.5～18.5℃，低于混合液共晶点，可保障样品的冻实度；在一次干燥阶段，工艺温度未超过混合液的塌陷温度，可保障样品的多孔结构与效价。

2.2 冻干程序建立

结合猪瘟耐热配方混合液的热参数性能，将预冻阶段的隔板温度取值为-42℃，一次干燥阶段的隔板温度设为-20℃、-15℃、-10℃和0℃，通过观察样品的冻干形态可见，在一次干燥阶段隔板温度为0℃时，样品底部出现明显收缩现象、冻干形态较差。而依照预先设定的冻干程序进行疫苗耐热性能测试可知，其耐热损失仅为0.51Lg，残水率<3%，且复核结果显示耐热损失为0.46Lg。在现有0.15㎡冻干机的基础上进行工艺放大，分别选取3个批次样品进行测试与记录，可观察到在0.5㎡冻干机上的三个样品批次的冻干损失分别为0.17±0.09、0.19±0.04、0.35±0.03，耐热损失分别为0.9±0.08、0.78±0.1、0.9±0.03，冻干损失均<0.4Lg、耐热损失均<1.0Lg，符合要求、实现可重复性；而2㎡冻干机上样品的耐热损失为1.8±0.12，残水率为3%±0.17%，需通过降低一次干燥阶段的隔板温度、增加干燥时间，方可保障获得良好的冻干效果、实现可重复性。此外，需注重控制好冻干规模在2㎡条件下的冻干程序与工艺，降低一次干燥阶段的隔板温度、延长冻干时间。