线粒体Lon 蛋白酶及其相关疾病的研究进展

杨硕瑶 ，戚紫怡，向 军

1. 上海交通大学仁济临床医学院，上海200127；2. 上海-渥太华联合医学院，上海 200127；3. 上海交通大学瑞金临床医学院，上海 200025；4. 上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤整形科，上海 200025

Lon 蛋白酶（Lon protease，LON）是一种依赖ATP的丝氨酸蛋白酶，亦是与多种细胞活动相关的ATPase 蛋白家族成员之一，具有丝氨酸-赖氨酸催化结构，能够在降解折叠错误及损伤蛋白质、维持细胞内环境及结构的稳定方面发挥重要作用。20 世纪80 年代细菌及酵母菌中的LON 被发现，而后人类LON 的基因和蛋白质结构也于1993 年被揭示[1]。随着对LON 结构与功能的深入了解发现，LON 在退行性疾病、衰老及机体缺血缺氧进程中均存在异常表达，而通过酶抑制剂、基因调控等或可对LON 进行定向干预，从而延长患者寿命以及提高其生活质量。本文就LON 及其与疾病关系的研究进展进行综述。

1 LON 的结构及存在部位

LON 在细菌、酵母菌及哺乳动物体内均存在同源蛋白质，进化过程中高度保守，具有显著的进化保护作用。细菌LON 也称蛋白酶La，酵母LON 也称Pim-1[2]。目前，已知的人类LON 有2 种，即线粒体LON（LONP1）和过氧化物酶体LON（LONP2），其中相关研究多聚焦于前者。LONP1 由核基因LONP1 编码而成，该基因位于19 号染色体p13.2。翻译出来的LONP1 的N 端带有线粒体靶向序列（mitochondrial targeting sequence，MTS），可引导其进入线粒体，而后MTS 被剪切形成成熟的LONP1。LONP1 由956 个氨基酸组成，相对分子质量约100 000；从N 端到C端共包括3 个功能区，依次为底物识别区、ATP 酶区和蛋白水解区。研究[3]发现，90%的LONP1 以可溶形式存在于线粒体基质中，10%则存在于线粒体内膜。LONP1 常以六聚体的形式存在，形成中空的环状结构，能够特异性地将底物包裹，催化蛋白质水解，而当以单体形式存在时则无蛋白酶活性[4]。LONP1 广泛存在于各种细胞，在肝脏、脑、心脏、骨骼肌和胎盘组织中高度表达，而在肾脏、肺、胰腺和免疫器官也有一定的表达[2]。与LONP1 相似，LONP2 由852 个氨基酸组成，相对分子质量约95 000。LONP2 的基因位于16 号染色体，经翻译后可通过其C 端的过氧化物酶体定位信号（peroxisomal targeting signal 1，PTS1）靶向过氧化物酶体基质，且该蛋白酶同样含有3 个功能区[5]。LONP2 在人的胰腺、肾脏和肝脏组织中高表达。与LONP1 不同，LONP2 的保守性相对有限[6]。

2 Lon 的功能

在细胞的新陈代谢中，蛋白质的合成和降解是一个动态平衡的过程，即不断有新的蛋白质合成，同时又有结构受损或功能丧失的蛋白质被清除，从而维持内环境的稳定。在胞质及胞核中，承担蛋白质的降解以及回收利用的主要执行者是泛素-蛋白酶体系统。而在线粒体中，承担此功能的就是LON。有文献[4]表明LONP1 在线粒体中发挥了重要的“清道夫”功能，其可选择性地降解异常蛋白质，如折叠错误、突变的蛋白质，以及某些寿命短暂的调控蛋白质，对维持线粒体及细胞的功能具有重要意义。同样，LONP2 在过氧化物酶体中也承载了相似的功能[5]。

线粒体是细胞重要的“能量工厂”，同时还参与细胞的信息传递、分化及凋亡等过程，并可调控细胞生长及细胞周期。LONP1 作为线粒体内的“多面手”，是线粒体代谢和自由基损伤反应的主要调节因子，包括蛋白质的质量控制和线粒体功能的维护。目前LONP1 在细胞内的功能尚未被详尽阐释，但已知其至少存在3 种不同的作用，具体介绍如下。

2.1 蛋白酶功能

越来越多的研究[7]发现，作为水解受损蛋白质的蛋白酶和特定的线粒体酶，LONP1 的作用底物较为广泛，包括特异和非特异2 种。其中，特异底物包括乌头酸酶、线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A， TFAM）、类固醇合成急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）、细胞色素c 氧化酶4 亚型1 （cytochrome c oxidase 4 isoform 1，CcO4-1）、胱硫醚β 合酶、谷氨酰胺酶C、氨甲酰基转移酶（ornithine transcarbamylase，OTC）等。乌头酸酶是催化柠檬酸和异柠檬酸相互转化的酶，在三羧酸循环中具有重要作用，常作为氧化应激的标志物。TFAM 能够直接调控哺乳动物的线粒体DNA 拷贝数，而LONP1 可通过控制TFAM 的降解来实现对DNA拷贝数的调控。StAR 是肾上腺皮质和性腺中类固醇激素产生所需的激素生成急性调节蛋白，可介导胆固醇进入线粒体内膜，从而在线粒体内膜转化为类固醇[8]。LON 参与StAR 水解，后者可通过作用于核呼吸因子2（nuclear respiratory factor 2，NRF-2）通路刺激其转录，形成一个调控环[9]。CcO 是细胞呼吸电子传递链末端的酶，具有质子泵的作用，可将H+由基质抽提到膜间隙，同时还可通过血红素中铁原子的氧化还原变化，把电子传递给氧形成水，在ATP 的产生过程中具有重要作用。此外，CcO也参与了机体的氧化应激过程[10]。在非耐药肿瘤细胞中CcO4-1 的水平有所降低，在耐药肿瘤细胞中CcO 的活性明显增强，而在帕金森病等神经退行性疾病中CcO 活性是下调的[11]。因此，LONP1 通过水解调控上述蛋白，对生命过程产生重要影响。

2.2 线粒体DNA 的结合蛋白

LONP1 能够结合线粒体DNA 中重要蛋白质基因的启动子序列，如线粒体酶、解旋酶、TFBM、TFAM 等，影响这些蛋白的表达水平，间接参与调节线粒体DNA 复制和有丝分裂。

2.3 蛋白伴侣

采用免疫共沉淀技术对LONP1 进行研究发现，其可与76 种不同的线粒体蛋白结合，如热休克蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）、肌球蛋白9/10、葡萄糖调节蛋白78、原钙黏蛋白18 等[12]。其中，LONP1 可通过与Hsp60 相互作用来维持HSP60 的稳定，参与细胞应激反应，从而在恶劣环境下保护细胞。

3 LON 的表达和调控

诸多转录因子可能参与了LON 基因的表达调控。LONP1 的一个启动子区是-623/+1，包含1 个NRF-2结合位点，且NRF-2 是活性氧反应因子，可通过调控LONP1 的表达促进线粒体DNA 的复制和转录[13]。另一个非常重要的启动子区是-2023/-1230，包含核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）结合位点，该位点的存在进一步证明了LONP1 能够参与细胞应激及肿瘤形成过程。低氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）也能显著诱导 LONP1 的表达，已发现LONP1 启动子包含5 个 潜在HIF-1 结合位点。染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）实 验 证 实HIF-1α 和HIF-2α 均可与LONP1 相结合[14]。表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）是参与肿瘤转化的主要因子之一，而线粒体稳态的破坏则是肿瘤的重要特征。研究[15]发现，EGF 能够对LONP1 的表达进行调控，该过程由2 个重要的致癌途径介导，即胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK） 途 径 和 磷 酸 肌 醇3- 激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K） 途 径。 此 外，LONP1 的表达也受到翻译后的多种调控。定位在线粒体的去乙酰化酶3（sirtuin 3，SIRT3）可介导LONP1 去乙酰化，而沉默SIRT3 可导致LON 水平及其乙酰化水平均有所升高，但并不会影响mRNA 的表达水平[16]。

4 LON 的异常表达与相关疾病

4.1 LON 基因突变

LONP1 基因突变导致其蛋白与ATP 结合发生异常，从而不能有效利用ATP。临床研究[17]发现，LONP1 突变可直接导致人脑、眼、牙、耳、骨（足）异常，简称CODAS综 合 征（cerebral，ocular，dental，auricular and skeletal anomalies syndrome）。CODAS 综合征是一种罕见的先天性疾病，表现为多系统发育异常，其临床特征多样，包括典型线粒体遗传病的症状如智力障碍、残疾、身材矮小、听力丧失、视力下降、肌张力低下、上睑下垂和运动迟缓等，也包括CODAS 综合征特有的骨骼和牙齿异常等症状。CODAS 综合征的发现为LONP1 功能丧失而危害机体健康提供了证据。在针对小鼠的一项研究[18]发现，Lonp1-/-小鼠在胚胎期即发生死亡；而Lonp1+/-小鼠则发育正常，但其组织中LONP1 的mRNA 和蛋白质水平下降了一半。因此该研究进一步证实，LONP1 是机体生存所必需的。

4.2 LON 表达下调

多项研究表明，LON 表达下调与衰老密切相关。Hoshino 等[19]针对老年大鼠、年轻大鼠肌组织中LON 表达水平进行研究发现前者为后者的25%；虽然随年龄的增加，锻炼和热量摄入限制会抑制LON 表达下降，但老年大鼠Lon 的可诱导性则出现了大幅度降低或完全丧失。同时，该研究还发现在不同组织中LON 表达水平随年龄的变化存在一定差异，即老年大鼠肝脏中LON 表达水平无明显变化、LON 活性降低到40%，而老年大鼠心脏中其蛋白水平是年轻大鼠的5 倍、总活性保持不变，推测LON 表达水平的增加是单位质量酶活性下降的补偿。因此，该研究证实在衰老过程中机体将伴随LON 功能不足。一般认为，急性应激原如热休克、血清饥饿、氧化应激等可导致LONP1 在较长时间内表达上调，并伴随异常蛋白清除增加及细胞生存率升高[20]。然而，慢性和严重的应激状态如广泛的缺氧或长期的氧化应激可导致LONP1 表达下调，在老化的细胞中均出现LONP1 下调的情况。针对柄孢霉（Podospora anserina）LON 的研究发现，该酶表达上调可延长柄孢霉的寿命，而对其呼吸、生长、繁殖等均无不利影响，同时可增加ATP 依赖性蛋白酶活性，产生低水平的氧化蛋白、糖化蛋白及。因此，未来或可通过维持LON 的活性、诱导异常蛋白的清除来延缓衰老、延长寿命以及提高老年生活质量。

LONP1 的下调还参与了一系列神经退行性疾病如帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症等的发生与发展。由于LONP1 表达的下调，使得异常蛋白质的降解受阻而出现堆积，导致线粒体功能紊乱、结构丧失，继而诱发凋亡[22]。如在早发性常染色体隐性帕金森病中，编码PTEN诱导激酶1（PTEN-induced kinase 1，PINK1）的PARK6基因可发生突变；然而在健康细胞中PINK1 能够被快速降解。由于LONP1 表达的下降使得PINK1 在线粒体基质中大量堆积，继而诱发线粒体自噬，导致帕金森病的发生。除神经退行性疾病外，精神障碍性疾病如焦虑和抑郁的发生也被认为与氧化应激引起炎症以及相应的毒性蛋白的清除能力下降有关[23]。

LONP1 水平还与2 型糖尿病的胰岛素抵抗及肝脏糖异生功能异常有关。研究[2]显示，LONP1 表达下调会导致胰岛素信号传导受损、葡萄糖异生酶水平升高，而其过表达则会降低胰岛素抵抗，缓解2 型糖尿病。

4.3 LON 表达上调

在一些线粒体相关疾病如遗传性共济失调（hereditary ataxia，HA）、肌阵挛癫痫伴破碎红纤维（myoclonic epilepsy and ragged-red fibers，MERRF）综合征中，常伴有LON表达上调或活性增强[2]。目前，在上述疾病中，LONP1 功能的变化在疾病中的作用尚未被阐明。

在脑缺血与心肌缺血疾病的发展过程中，由于机体缺血、缺氧，LONP1 的表达则有所增加[9]。在心肌缺血-再灌注损伤下，CcO4-1 的降解逐渐增加。CcO4-1 功能的受损可诱导产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），继而发生线粒体功能障碍诱导心肌细胞凋亡[24]。因此，有望通过抑制LONP1 的表达改善由缺氧诱导的心肌损伤。在缺血性脑卒中大鼠模型（大脑中动脉闭塞）中，脑缺氧/缺血可引起严重的内质网应激，而LON 的mRNA 和蛋白质水平则出现上调，也证实了LON 参与内质网应激反应这一过程[25]。

目前有较多资料显示，肿瘤的发生、发展及转移与LONP1 的长期表达上调密切相关。在多种肿瘤如淋巴瘤、肝细胞癌中，与非癌组织相比，癌组织具有更高水平的LONP1 表达和活性；且在宫颈癌组织中LONP1 的表达比健康宫颈组织高出2 倍[26]。敲除LONP1 则能够抑制肿瘤细胞的增殖、降低细胞呼吸，限制肿瘤的发生与发展。同样地，在结肠癌中沉默LONP1 可降低线粒体DNA 和氧化磷酸化复合物水平，改变线粒体蛋白组的表达，从而抑制线粒体功能，促进细胞死亡[27]。

总之，LONP1 的表达异常可破坏细胞内环境的稳定，是多种慢性疾病的潜在致病因素。

5 LON 的干预

基于LON 与疾病、衰老的发生密切相关，以及蛋白酶体抑制剂在临床的应用，科学家们逐渐对LON 的干预药物的研发产生了兴趣。在蛋白酶体抑制剂中，MG132、MG262 能够抑制LON 活性，且两者对LON 的抑制效率是对20S 蛋白酶体的2 000 倍[28]。香豆素衍生物是首个被报道的具有潜在利用价值的非多肽小分子LON 抑制剂，且未发现其有抑制其他蛋白酶（如蛋白酶体）的能力，其可能穿过血脑屏障在大脑中发挥作用，有望成为治疗中枢神经系统恶性肿瘤的药物[29]。CDDO（2-cyano- 3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid）及其衍生物可通过抑制LON 水解活性促进B 淋巴细胞凋亡。在恶性淋巴瘤细胞中，LON 表达水平显著升高，而LON 表达下调则会导致淋巴瘤细胞死亡，进一步证明了线粒体LON 可能成为新的抗癌药物靶点[27]。Obtusilactone A 和（-） -sesamin是从肉桂中提取的2 种化合物，是强效的LON 抑制剂，能够与LON 活性位点Ser855 和Lys898 残基结合而发挥作用。在LON 表达水平较高的非小细胞肺癌细胞系中，Obtusilactone A 或（-） -sesamin 可下调LON 的表达，从而触发由caspase-3 介导的细胞凋亡[30]。虽然在衰老或神经退行性疾病中LON 的功能不足，诱导LON 或将是一个较好的策略，但目前仅有少量的采用基因手段开展的实验室干预研究，尚未见相关成熟报道。

6 总结与展望

综上所述，LON 在维护细胞内环境的稳定方面发挥了重要作用，其异常表达跟多种疾病和衰老密切相关，因此开发靶向LON 的临床药物或将是疾病治疗与衰老干预的又一方向。但目前，有关LON 如何参与体内的生理过程还有较多未知的地方，例如LON 在细胞应激反应中如何精确调控与被调控，其异常表达所带来的影响将涉及哪些方面。鉴于肿瘤伴随LON 功能的增强，而衰老伴随LON 功能的降低，在矛盾的两侧我们将如何来精准干预仍有待深入研究。

参·考·文·献

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