急性抗体介导排斥反应中NTPDase1代谢胞外ADP失衡致移植物损伤研究进展

张勇，王晓雁，薛芃，魏光柱，刘雪欢

首都医科大学附属北京天坛医院，北京100070

随着器官移植技术不断成熟、移植免疫基础研究不断深入和免疫抑制剂不断开发，器官移植成为临床治疗终末期器官功能衰竭的有效手段。但各种因素导致的移植物失功能是国际器官移植领域亟待解决的难题之一。目前认为，排斥反应是导致移植物失功能的主要原因之一。急性排斥反应一般发生在器官移植术后数小时至一个月内，可分为T细胞介导的急性细胞性排斥反应和B细胞参与的急性抗体介导排斥反应(AMR)[1]。与T细胞介导的急性细胞性排斥反应相比，B细胞参与的急性AMR治疗效果更差，属于难治性急性排斥反应之一[1～3]。急性AMR发生时，血小板活化、B细胞激活、巨噬细胞功能上调直接或间接导致移植物不可逆性损伤。三磷酸核苷双磷酸水解酶1(NTPDase1)是一个钙、镁离子依赖的核苷三磷酸二磷酸水解酶，可以水解细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)为单磷酸腺苷。NTPDase1表达于成熟的B细胞、血小板和巨噬细胞等，能够维持其胞外ADP平衡，使这些细胞处于静息状态。急性AMR发生时，NTPDase1代谢胞外ADP平衡被打破，改变了B细胞、血小板、巨噬细胞等静息状态，从而导致移植物损伤[4～7]。因此，NTPDase1相关通路导致的血小板活化、B细胞激活和巨噬细胞功能上调在急性AMR移植物损伤中的作用越来越受到关注。本文结合文献就急性AMR中NTPDase1代谢胞外ADP失衡致移植物损伤的研究进展作一综述。

1 急性AMR中移植物损伤概述

器官移植被誉为20世纪外科领域的三大医学进展之一，已经成为临床救治终末期器官功能衰竭的有效手段。目前，困扰器官移植进一步发展的一个亟待解决的难题是排斥反应。在临床上，一般将排斥反应分为超急性排斥反应、急性加速性排斥反应、急性排斥反应和慢性排斥反应四类。其中，急性排斥反应又分为急性T细胞介导的排斥反应和急性AMR。20世纪90年代以前，医学界普遍认为急性排斥反应主要是由细胞免疫介导的，直至有学者发现人类白细胞抗原(HLA)抗体在移植肾排斥反应中具有重要作用，急性AMR才受到重视[8]。AMR主要是由抗体、补体等体液免疫成分参与所致的免疫损伤，大多发生在移植术后2～3周，也可表现为慢性过程[9，10]。随着对T细胞介导排斥反应的有效控制，AMR成为排斥反应预防和诊治的核心内容。在急性AMR中，特异性抗体与移植物内皮细胞的特异性靶点结合，通过经典途径激活补体，不仅可以直接攻击移植物，还可以激活淋巴细胞，而淋巴细胞通过免疫反应和炎症反应攻击移植物，最终导致移植物不可逆性损伤[11]。

2 NTPDase1的结构和功能

1982年，Rowe等首次发现EB病毒感染的B淋巴母细胞表面存在一种特殊的分子标志物，之后被命名为CD39，即NTPDase1。NTPDase1是一个含有约510个氨基酸的跨膜蛋白，由7个N-糖基化位点、11个半胱氨酸残基和2个跨膜区域组成。在结构上，NTPDase1由两个跨膜区域组成，一个为含有N端和C端的胞质区域，一个为含有5个ATP酶保守区的胞外疏水区域。胞外疏水区域是维持NTPDase1结构和功能的必需区域[6，7]。

NTPDase1是一个钙、镁离子依赖的核苷三磷酸二磷酸水解酶，可表达于血管内皮细胞及成熟的B细胞、血小板和巨噬细胞，主要生物学功能是催化水解细胞外ATP和ADP为单磷酸腺苷，同时释放能量，从而维持胞外磷酸腺苷的动态平衡，维持B细胞、血小板和巨噬细胞处于静息状态。近年研究发现，NTPDase1在缺血再灌注损伤保护、免疫炎症反应、血栓形成及促进肿瘤生长、转移等方面具有重要作用[6，7]。NTPDase1可以激活A1和A3腺苷酸受体，通过蛋白酶C和线粒体的ATP敏感性钾通道，在缺血再灌注损伤中保护心脏等重要器官；在器官移植中，NTPDase1通过腺苷A2A受体介导的信号通路，对供体缺血再灌注损伤具有保护作用。NTPDase1结合NTPDase1-5′核苷酸酶-腺苷受体，通过激活磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通道，磷酸化抑制糖元合成酶激酶-3β，开放ATP敏感性钾通道，保护线粒体功能，从而阻止中性粒细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞的炎症因子释放，抑制免疫反应和炎症反应。NTPDase1通过调节血小板聚集相关的ADP依赖的P2Y1受体，直接参与血小板活化和血栓形成。肿瘤内部的坏死细胞及其周围被杀伤的细胞可释放细胞因子和化学因子，能够上调NTPDase1表达，NTPDase1消除细胞外肿瘤微环境中的ATP，从而加速肿瘤生长；NTPDase1还可通过抑制抗肿瘤免疫反应和提高血管生成，促进肿瘤生长和转移。

3 急性AMR中NTPDase1代谢胞外ADP失衡介导移植物损伤的机制

目前，大部分学者认为，急性AMR发生时特异性抗体与移植物内皮细胞的特异性靶点结合，通过经典途径激活补体，不仅可直接攻击移植物，还可激活淋巴细胞，通过免疫反应和炎症反应攻击移植物，最终导致移植物不可逆性损伤。然而，急性AMR中移植物损伤的机制非常复杂，除了上述经典途径外，NTPDase1也发挥了重要作用。在急性AMR中，特异性抗体对移植物的攻击及药物因素、机械因素、血液动力学因素等能够引起移植物血管内皮损伤，失去正常结构的血管内皮细胞跨膜蛋白-NTPDase1不能正常发挥催化水解细胞外ADP的生物学功能，导致胞外ADP蓄积，胞外ADP的生成和NTPDase1对胞外ADP的水解代谢失衡，进一步通过血小板、B细胞、巨噬细胞介导移植物不可逆性损伤，导致移植器官失功能。

3.1 NTPDase1代谢胞外ADP失衡致血小板活化、血栓形成 在急性AMR中，移植物血管内皮细胞损伤，NTPDase1结构被破坏，导致NTPDase1不能正常催化水解细胞外ADP，导致胞外ADP蓄积。胞外ADP是血小板活化的重要激动剂，血小板的活化启动瀑布式凝血反应，导致移植物内血栓形成，移植物血供进行性下降，最终导致移植物不可逆性损伤。因此，在急性AMR中NTPDase1代谢胞外ADP失衡致血小板活化、血栓形成是导致移植物损伤的重要途径之一。

在静息状态下，血小板胞外ADP的生成和NTPDase1对ADP的水解处于动态平衡状态，从而维持血小板功能稳定。在急性AMR中，特异性抗体对移植物和移植物血管内皮细胞特异性抗原的攻击以及药物因素、机械因素、血液动力学因素等，能够引起白细胞趋化、聚集、黏附，导致移植物血管内皮细胞损伤，同时移植物血管内皮细胞表面的跨膜蛋白-NTPDase1结构受到破坏，最终导致NTPDase1不能正常催化水解细胞外ADP，胞外ADP蓄积，NTPDase1代谢胞外ADP失衡[12～14]。而胞外ADP是血小板活化的重要激动剂，可与血小板表面特异受体结合，导致血小板钙离子内流、血小板内腺苷酸环化酶和磷脂酶C活性改变，从而导致血小板活化、黏附、聚集和血栓形成[15]。

活化的血小板及其产生的炎症介质介导了移植物不可逆性损伤，导致移植物失功能。活化的血小板及其产生的炎症介质作用途径[16～21]：①血小板黏附在损伤的血管内皮，启动了瀑布式凝血反应；②血小板的脂氧化酶产物促使白细胞产生白三烯，白三烯促使中性粒细胞和嗜酸性粒细胞黏附于血管内皮；③血小板激活因子可增加血管通透性、促进白细胞聚集和黏附，从而促进吞噬氧化能力，造成血管内皮损伤；④IL-1表达上调，能够促进免疫细胞成熟、活化、增殖，在免疫调节过程中发挥重要作用；⑤血小板衍生生长因子诱导巨噬细胞、成纤维细胞游走，不仅能促进血小板的凝血功能，还能激活移植部位免疫系统功能；⑥转化生长因子β能够参与组织损伤和修复，调节细胞外基质形成，参与炎症、损伤与修复等病理生理过程。总之，移植物内皮损伤与血小板活化相互加强，反复放大，进而造成了移植物不可逆性损伤。

在急性AMR中，微血栓形成是介导移植物不可逆性损伤的关键环节之一；抑制血小板活化和血栓形成，阻断其介导的移植物损伤是治疗器官移植后急性AMR的潜在途径[22，23]。有研究报道，移植术前血小板处于活化状态的尿毒症患者移植后可出现血栓形成，而且活化的血小板通过产生一系列炎症介质促进移植后血小板与内皮细胞间的黏附、血小板相互聚集及血小板与白细胞的黏附等，成为术后急性排斥反应的始动因素；移植后出现的急性AMR也可通过血管内皮损伤等途径导致NTPDase1代谢胞外ADP失衡，引起胞外ADP蓄积和血小板活化[24～27]。这些研究佐证了NTPDase1代谢胞外ADP失衡能够导致血小板活化、血栓形成，进而引起急性AMR中移植物不可逆性损伤。

3.2 NTPDase1代谢胞外ADP失衡致B细胞激活 在急性AMR中，移植物血管内皮细胞NTPDase1结构受损，NTPDase1不能正常催化水解细胞外ADP，导致胞外ADP蓄积；胞外ADP通过第一信号系统活化B细胞，继而产生大量抗体，通过抗原抗体反应直接攻击移植物，B细胞活化后还可产生大量炎症介质，通过不同途径攻击移植物，最终导致移植物不可逆性损伤。因此，在急性AMR中NTPDase1代谢胞外ADP失衡致B细胞活化也是导致移植物损伤的重要途径之一。

在静息状态下，90%以上的B细胞可表达NTPDase1，仅6%的T细胞可表达NTPDase1，而且B细胞表达NTPDase1的活性也高于T细胞，故NTPDase1能够通过催化水解B细胞外ADP来维持B细胞的功能稳定[28]。当急性AMR发生时，胞外ADP生成和NTPDase1对ADP的水解失衡，B细胞被激活；被激活的B细胞产生B细胞活化因子等炎症介质，这些炎症介质通过B细胞受体依赖性和非依赖性机制促进未成熟的B细胞分化，进一步打破免疫平衡状态；同种异体抗原、B细胞活化因子等因素能够刺激B细胞分化为浆细胞，并分泌供体特异性抗体(DSA)，DSA可与移植物内皮细胞的特异性靶点结合，激活补体，从而直接攻击移植物[29，30]。因此，B细胞一旦被激活，不仅可通过分泌DSA攻击移植物，还可通过多种炎症介质诱导B细胞、T细胞、单核细胞、血小板相互作用，放大瀑布式免疫反应，造成移植物不可逆性损伤。

Zhang等[12～14，24]探讨了NTPDase1与胞外ADP蓄积和B细胞活化的关系、激活B细胞与肾移植急性AMR的关系、B细胞活化与移植肾间质纤维化的关系，以及抑制血小板活化对逆转急性AMR和延缓移植肾间质纤维化的效果，结果发现，肾移植急性AMR发生时，活化的B细胞NTPDase1表达活性明显升高；急性AMR发生时，血小板活化增加并与移植肾间质纤维化密切相关，抑制B细胞和血小板活化对逆转急性AMR和延缓移植肾间质纤维化具有一定效果。进一步佐证了在急性AMR中NTPDase1代谢胞外ADP失衡致B细胞激活可造成移植物不可逆性损伤。

3.3 NTPDase1代谢胞外ADP失衡致巨噬细胞功能上调 在急性AMR中，血管内皮细胞NTPDase1结构和功能受损，导致巨噬细胞外ADP蓄积；胞外ADP能够活化巨噬细胞，而活化的巨噬细胞可直接吞噬和消化移植物，导致移植物不可逆性损伤。因此，急性AMR中NTPDase1代谢胞外ADP失衡致巨噬细胞活化也是导致移植物损伤的重要途径之一。

巨噬细胞属于免疫细胞，主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行吞噬和消化，并激活淋巴细胞等免疫细胞，继而对病原体作出反应。目前，NTPDase1代谢胞外ADP失衡与巨噬细胞功能上调的关系尚不完全清楚。研究表明，巨噬细胞有三种活化途径[30]：①经典活化的巨噬细胞需要自然杀伤细胞的产物为第一信号，肿瘤坏死因子为第二信号，但在生理上第二信号通常是由Toll样受体的配体诱导巨噬细胞自身产生内源性的肿瘤坏死因子；②替代性活化的巨噬细胞需要有合适的诱导剂；③Ⅱ型活化的巨噬细胞需要两个信号。NTPDase1代谢胞外ADP失衡似乎可以通过上述三种途径上调巨噬细胞活性，加强其对移植物细胞残片的吞噬和消化，从而导致移植物细胞固有结构损伤，介导移植物不可逆性损伤。

综上所述，急性AMR发生时NTPDase1代谢胞外ADP失衡，能够通过相关通路导致血小板活化、B细胞激活和巨噬细胞功能上调介导移植物不可逆性损伤。因此，进一步研究急性AMR中NTPDase1导致的血小板活化、B细胞激活和巨噬细胞功能上调的作用机制，有助于早期诊断和有效治疗急性AMR，保护移植物功能，从而使移植物长期存活。