非洲猪瘟病毒分子生物学检测方法研究进展

李天芝，于新友

（山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）

非洲猪瘟病毒（ASFV）属非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属病毒。病毒粒子有囊膜，大小约175～215 nm，只有1个血清型。ASFV为线状双链DNA病毒，基因组大小170～190 kb，两端为可变区，中间为保守中心，包含ORF150个，可编码150～200种蛋白，其中结构蛋白28种[1]。根据P72基因序列的差异，可分为24种不同的基因型，中国流行的主要是基因Ⅱ型。病毒对外界环境抵抗力强，尤其在湿冷环境可长期存活。ASFV宿主范围较窄，仅感染猪致其发生非洲猪瘟（ASF），该病是一种高度接触性传染病，以高热、厌食、皮肤发绀、内脏器官广泛出血及高死亡率为特征[2]，但通常传播速度慢。世界动物卫生组织（OIE）规定ASF为必须通报的动物传染病，中国则将其定为一类动物疫病[3-4]。ASFV感染猪只后可在其体内大量增殖，但抗体产生速度较慢，且一般不产生中和抗体。

自2018年8月ASF首次报道以来，迅速席卷我国，不仅给养猪业造成严重的经济损失，还造成重大的经济、社会和政治影响[5-6]。目前尚无有效的商品化疫苗可用，也无有效治疗药物。其所引起的病变与猪瘟及细菌性败血病等病变类似，因此，仅通过剖检有时很难做出正确诊断，需借助实验室方法确诊。抗体检测存在一定的缺陷，抗体产生的滞后性和抗体检测不能判定现症感染，故一般采取病原学方法进行确诊。由于方法本身局限性及国家相关政策等影响，传统的病原分离，间接免疫荧光满足不了临床样本检测的需求，针对ASFV核酸的分子生物检测方法是最适宜该病检测方法。该病防控主要依靠扑杀感染动物、完善的生物安全措施，为满足现场早期、快速、准确排查ASF疫情，阻止疫情在国内的进一步蔓延的需求，需借助先进、科学、经济的分子生物学检测方法。本文阐述ASFV的分子生物学检测方法研究进展情况，为ASF的诊断及防控工作提供参考。

1 核酸探针

核酸探针又称核酸杂交，利用核苷酸碱基顺序互补的原理，用能特异性识别碱基序列（靶序列）一段单链DNA（或RNA）分子作标记，与被测定的靶序列互补，以检测被测靶序列的技术。张鑫宇等对22株发表的非洲猪瘟病毒（ASFV）p72基因序列进行比较，根据保守的基因序列，各设计、合成1条与保守区域互补的5'生物素标记及3'烷巯基修饰短链寡核苷酸探针，并将烷巯基修饰的探针吸附到纳米金颗粒上，制备纳米金标记探针，PCR扩增出的p72基因中的651 bp保守核酸序列，变性后与上述生物素探针及标记纳米金探针进行杂交，杂交产物加入吸附链霉亲和素的酶标板，利用亲和原理，捕获杂交产物，银染增强法对纳米金标记探针进行信号放大，结果表明，制备的纳米金探针经银染放大后，在酶标板中形成肉眼可见的黑色沉淀，可实现有效检测ASFV p72扩增基因，对核酸检测敏感度为10 fmol·L-1[7]。

2 纳米PCR

纳米PCR技术是将纳米材料应用PCR所形成的一门新兴技术，纳米金粒子的应用可提高酶的活性和稳定性，改善非特异性扩增现象，提高PCR检测特异性，缩短PCR反应时间，检测敏感性是常规PCR的100倍，使检测更加准确、可靠[8]。崔尚金等建立了ASFV的高效纳米PCR检测方法，该方法采用纳米金颗粒作为热导介子，提高了PCR反应效率，采用该方法同时检测ASFV、大肠杆菌、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪捷申病毒、猪脑心肌炎病毒等，结果只有ASFV能够扩增出552 bp的目的片段[9]。敏感性实验表明，纳米PCR检测技术是常规PCR检测技术敏感性的1 000倍以上，最低核酸拷贝数检出量可以达到10个拷贝。

3 多重PCR法

多重PCR是一种特殊的PCR技术，在同一PCR体系中，加入多对引物，同时检测2种或2种以上的病毒DNA，具有快速、灵敏度高、高效、特异性强等优点而广泛用于临床的快速诊断。任梅渗等参考PRV、CSFV、ASFV、PRRSV、副猪嗜血杆菌（HPS）、胸膜肺炎放线杆菌（APP）以及多杀性巴氏杆菌（PM）标准毒株序列，选择各病毒和细菌的保守序列分别设计7对特异性引物进行多重PCR，各项优化试验结果表明，当反应的退火温度为51℃，各条引物浓度均为0.8 μmol·L-1时扩增的目的条带效果最佳，用敏感性试验检测该反应中各病毒的最小检出量分别为：1.01×102（PRV）、1.48×103（CSFV）、1.07×104（ASFV）、9.73×103（PRRSV）、1.82×103（HPS）、1.65×103（PM）和 3.64×103（APP）copies·μL-1，在最优化的反应条件下进行特异性试验，结果未出现交叉反应，能检出对应病原的多种血清型，阴性对照均无非特异性扩增[10]。冷依伊等根据GenBank中登录的ASFV、水疱性口炎病毒（VSV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、CSFV以及PRV参考病毒株序列，选择各病毒的保守序列设计5对特异性引物，通过优化反应条件，建立了一种可以同时快速检测以上5种病毒的多重PCR检测方法，结果显示，该方法对不同的细菌或病毒模板扩增结果均为阴性，特异性强，敏感性试验表明该方法对PRV、CSFV、ASFV、VSV和FMDV的核酸最少检出量分别为 8.82×103、6.87×104、5.71、4.93×104和4.32×102copies·μL-1，以上结果表明该方法快速、灵敏、特异性强[11]。

4 荧光定量PCR

荧光定量PCR（qPCR）融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点，检测速度快、敏感高，可直接观察扩增结果，不需要后续电泳检测扩增产物，减少了对环境气溶胶污染的可能，避免了假阳性结果。据信号基团的不同，qPCR可以分为染料法和探针法两种。曾少灵等依据ASFV较保守的VP73基因序列，设计特异性引物与探针，建立了ASFV实时荧光PCR检测方法，并与OIE推荐用于检测ASFV的实时荧光PCR和普通PCR方法进行比对，结果显示，该法检测灵敏度与OIE荧光PCR方法相当，但比普通PCR方法高出至少10倍。该法最低检测限可达10 copies·μL-1病毒DNA，该法重复性和稳定性好，批内CV值为0.61%～1.14%，批间CV值为1.37%～3.14%[12]。王建华等根据ASFV CP530R基因序列设计1对特异性引物和探针，通过优化反应条件，建立了一种检测ASFV的Taq-Man-MGB探针实时荧光PCR方法，并对该方法进行了特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验评价，结果表明，该方法仅对ASFV发生特异性扩增反应，不与PRV、猪细小病毒（PPV）和PCV2、CSFV、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、PRRSV和猪流感病毒（SIV）发生交叉反应，具有良好的特异性。用该方法检测质粒标准对照的线性范围为6.1×102～6.1×109copies·μL-1，标准曲线方程为y=-3.449x+38.10，相关系数（R2）为0.999，最低可检测到61个拷贝的质粒标准对照分子，对5个不同浓度的质粒标准对照进行双份样品的4次重复检测，每个浓度质粒标准对照的Ct值变异系数均小于2.0%，具有良好的重现性[13]。王建华等根据ASFV CP530R基因、CSFV 5'UTR基因和高致病性PRRSV NSP2基因，分别设计3对引物和TaqMan探针，建立了能同时检测这3种病毒的多重荧光定量RT-PCR方法，结果表明，该方法仅对ASFV、CSFV和HPPRRSV呈现特异性扩增，不与PRV、PPV和PCV2的DNA以及PEDV和SIV的cDNA发生交叉反应，该方法对ASFV、CSFV和高致病性PRRSV的最低检出量分别为61、11和41 copies·μL-1，组内和组间重复性试验的Ct值变异系数均＜2.5%，具有良好的重现性[14]。

5 微滴数字PCR

微滴数字PCR（ddPCR）是第三代PCR技术，其原理是通过油包水技术将预混的PCR体系分割成数万个纳米级微滴，每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子，作为一个独立的扩增体系，通过荧光检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数[15]。根据泊松分布的原理以及出现荧光信号的微滴个数与比例，即可得出靶分子的起始浓度，从而实现靶分子的绝对定量[16]。不再需要标准曲线，不依赖Ct值或内参基因，可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，精确性更高。邬旭龙等针对ASFV K205R基因设计一对特异性引物和Taq Man探针，通过反应条件优化，建立了ASFVqPCR和ddPCR检测方法，并对两种方法的线性关系、灵敏性、特异性和重复性进行了评估，利用建立的ASFV检测方法对163份我国内和进境的组织样本及血清样本进行检测，血清样本经商品化ASFV ELISA试剂盒复检，评估不同方法检测结果的符合率，结果显示，建立的ASFV qPCR和dd PCR检测方法线性关系较好（R2≥0.998），ddPCR的最低检测限度可达到0.36 copies，在20 μL反应体系中约为10拷贝/反应，检测灵敏度是qPCR的10倍[17]。ASFV ddPCR检测方法具有很高的特异性和重复性，不与其他猪常见病毒发生交叉反应。

6 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增（LAMP）方法是日本学者Notomi等发明的一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，不需要复杂的仪器设备，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果可通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，具有灵敏度高、操作简单、反应时间短、临床使用不需要特殊的仪器等优点，特别适合在现场和基层部门应用。王华等通过对GenBank中ASFV p72蛋白基因序列进行分析，设计合成了内（FIP，BIP）、外（F3，B3）两对引物，通过对反应条件进行优化，建立了非洲猪瘟LAMP检测方法，结果显示，该方法在62℃恒温60 min即可完成，最低可检测到1×101copies·μL-1的病毒DNA，与常规PCR方法相比灵敏度高100倍，对ASFV、PCV2、PPV、PRV基因组DNA同时检测，结果仅有ASFV出现条带，而其他均未出现目的条带[18]。田纯见等根据ASFV高度保守的非结构DNA聚合酶G1211R基因设计引物，建立了ASFV实时荧光LAMP方法，并与荧光PCR检测结果进行比对，结果显示，该法检测灵敏度达21 pg，优于荧光定量PCR方法，重复性实验LAMP检测批内和批间变异系数均＜5%，该法特异性良好，与PCV2、PRV、CSDFV、PRRSV及昆虫核酸无交叉反应[19]。还有一种检测ASFV的LAMP扩增方法。该方法能在58℃恒温条件下50 min内完成检测反应，敏感性实验表明，最低可检出5 copies·μL-1的ASFV核酸，该法与健康猪样本、PRRSV和PPV核酸样本不发生交叉反应，特异性强。所建立的检测方法反应结束后，无需开盖，可避免气溶胶造成的污染。通过肉眼观察反应液颜色变化判读结果，若反应液呈黄色，结果判为阳性，若反应液呈橙红色，结果判为阴性。

7 重组聚合酶扩增技术

重组酶聚合酶扩增（RPA）技术是2006年由英国公司TwistDx Inc研发的一种核酸扩增技术[20]。该法利用重组酶、具有聚合链置换功能的DNA聚合酶、单链结合蛋白等三种酶代替了传统PCR的热循环解链过程，25～42℃等温条件下，30 min内实现对靶基因的指数级扩增，不需要昂贵的仪器设备，产物的检测可通过凝胶电泳、荧光检测仪、侧向流试纸条（LFD）、生物芯片等多种不同方法，具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、结果读取多元化、操作简便等优点，能满足疫病快速现场检测的需求[21]。王建昌等根据ASFV P72基因序列，设计引物，建立了一种检测ASFV的RPA等温扩增方法，结果表明，该法在38℃水浴锅中恒温反应30 min，即可实现对目的片段的有效扩增，以包含ASFV P72基因的ORF质粒为模板，RPA的检测限达到102copies，同OIE推荐的荧光PCR法最低检测限一致，该法仅特异性扩增ASFV P72基因，对口蹄疫病毒（FMDV）、CSFV、PRRSV、PRV和PCV2基因组c DNA或DNA没有扩增[22]。哈登楚日亚等针对ASFV p72基因设计了3组引物和探针，通过不断优化反应条件，建立了ASFV实时荧光RPA检测方法，结果显示，该法在39℃恒温条件下20 min内可完成检测反应，最低可检测10个copies的DNA分子，且与CSFV、PCV2、PPV、PRV均无交叉反应，检测5.5×106～5.5×100copies·μL-1共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度，变异系数范围在0.38%～28.30%[23]。缪发明等建立了一种简便、快捷的现地检测ASFV的方法，该法联合RPA和LFD技术，针对ASFV P72基因保守区域，设计两条引物和一条nfo探针，下游引物5'端标记生物素，nfo探针5'端异硫氰酸荧光素或6-羧基荧光素，3'端带有阻断物，序列内部标记THF分子，通过引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化建立了一种可以用于ASFV现地检测的RPA-LFD方法。该检测方法在38～46℃恒温反应10 min即可实现对ASF目的基因的有效扩增与CSFV、PCV2、猪乙型脑炎病毒（JEV）、PEDV、PRRSV、PRV等均无交叉反应，RPA扩增产物直接用LFD肉眼观察，最低检测限为102拷贝/反应，灵敏度与TaqMan荧光定量PCR相当[24]。

8小结

非洲猪瘟是国际公认对养猪业危害最严重的疾病，世界各国均高度重视，猪场一旦发病，按国家政策应全群扑杀。目前该病在全国均有流行，给养猪业造成毁灭性打击，使养猪人丧失养猪信心。中国是以散户为主的养殖模式，居民普遍喜食鲜肉，大规模生猪调运，注定非洲猪瘟的防控工作必将是一场持久战。虽然该病已流行近百年，但对其致病机理尚不明确，因病原独特性质，疫苗研究未取得突破性进展，甚至消毒剂及诊断制品的研究还不完善，还有大量工作要做。该病虽然全国范围多点散发，但传播速度非常慢，早期诊断后，通过相应的消毒及生物安全防控措施可将猪场损失降低。为开展非洲猪瘟分子流行病学调查，了解病毒传播途径，掌握疾病流行动态，防止疫情扩散和蔓延，需依靠大量快速、敏感、成本低、操作简单的高质量检测试剂。

当前ASFV分子生物学检测方法有多种，但各有利弊，探针检测法虽然可实现高通量检测，一次可检测大量样本，但操作较复杂。纳米PCR方法虽然检测速度快、敏感性高、特异性强，但不能实现对病原的定量检测，且纳米材料不易获得。多重PCR方法虽然可实现对多种疾病的快速筛查，但因所用引物众多，反应条件很难兼顾，致检测敏感性不高，易导致漏检。荧光PCR检测方法较成熟，检测速度快，可实现病原定量检测，但染料法特异性不好，很难筛选到好的引物，探针法探针合成价格较贵，且需要价格昂贵的仪器设备，很难在基层大面积推广应用。LAMP方法虽然简单、方便，适合基层进行推广应用，但引物设计复杂，且灵敏度太高，易出现假阳性结果，对非特异性扩增也很难鉴别。微滴数字PCR探针的设计同荧光PCR，原理复杂，操作对人员要求高，无需标准曲线，最低可检测单拷贝核酸分子，可实现待检靶样品核酸绝对定量，目前普及程度不如荧光PCR，同样不适合基层检测。重组聚合酶扩增技术所用试剂价格昂贵，检测成本高，引物设计规则不明。

当前对ASF无有效疫苗和治疗药物可用，只能靠严格的生物安全措施防控，制定严格标准，并严格执行，规范引种与卖猪流程，进出车辆严格消毒。人员按规定隔离、消毒和换洗衣物。加强猪饲养管理，提供适宜温度、湿度，降低猪只饲养密度，猪舍分割成小单元饲养，减少猪群应激。进出猪场饲料、药品、疫苗、物资等严格熏蒸消毒，猪舍定期清理粪尿，做好灭蚊蝇及灭鼠工作。选择质量有保证的厂家对ASFV有确定效果的消毒剂，如过硫酸钾复合物、戊二醛等，消毒剂配制浓度要合理，保证消毒时间，并注意外界环境温度，部分消毒剂在低温环境无效。

因中国流行的ASFV为强毒株，猪群常在抗体还未产生或抗体滴度不高时猪只已死亡，全球对非瘟都是扑杀政策，所以当前检测抗体的意义并不大，主要针对抗原检测。随着疾病的流行，ASFV可能会变为弱毒株，猪只出现隐性带毒情况，到时检测抗体可能更有意义。虽然针对ASFV病原检测方法有多种，但当前国家推荐的检测方法是荧光PCR，国家农业部组织了比对，推荐了一些质量符合要求的厂家。检测时可选取全血、血清、唾液、粪便、扁桃体、淋巴结、脾脏等样本，通常唾液中最早出现病毒，适合疾病早期筛查，一定要把握检测时间，早发现，早剔除，减少猪舍中病原载量，否则可能就没有意义。另外对检测的唾液样品最好不离心、不冻融，尽早检测，以提高检出率，否则可能会因核酸降解及病毒量减少造成漏检。活体检测排查病原是可采集血样，采样时一定要防止猪只见交叉污染，全血的检出率要高于血清。虽然公认病猪脾脏为检测的最佳组织，但一般不建议对疑似发病猪只解剖，以免造成大的污染面，可在腹股沟淋巴结切开一小口，取少量淋巴结检测。如果条件允许的话不要选择免核酸提取试剂盒，免核酸提取试剂盒虽然对病毒含量高的样本扩增无影响，但对环境采样或对病毒含量低的样本，少了核酸的富集和纯化过程，必然会减少样本阳性检出率。核酸手提法操作繁琐，时间长，对人员和仪器设备要求高，商品化核酸提取试剂盒分为柱式提取法和磁珠提取法两种，磁珠法更适合大量样本用核酸自动提取仪提取，不同厂家柱式法试剂提取效率不同。便携式荧光检测试剂及适合常温保存和运输的试剂在基层疾病的诊断中必将发挥巨大的作用。

随着技术的不断进步，科研工作者一定会开发出更多价廉、质优的检测试剂，以满足基层猪场及实验室检测需求，从而更好地防控非瘟，减少猪场损失，保障养猪业的健康发展。