基于超高效液相色谱-高分辨质谱联用的非靶向代谢组学分析普洱生茶和普洱熟茶醇溶性物质组成差异

2020-12-28汪生陈冠军臧丹丹胡江玲钱成冯蕊

安徽农业科学 2020年23期

汪生　陈冠军　臧丹丹　胡江玲　钱成　冯蕊

摘要 [目的]建立了基于超高效液相色谱-高分辨质谱联用的非靶向代谢组学方法分析普洱生茶和普洱熟茶中醇溶性差异物质。[方法]通过70%甲醇提取和液相色谱-高分辨质谱分析，结合保留时间的规律和数据库匹配鉴定物质，依据正交偏最小二乘法-判别分析表明两者间物质存在显著差异，结合模型的变量重要因子和非参数检验，筛选差异物质。[结果]普洱生茶和普洱熟茶中共鉴定出100个化合物。通过统计分析，2种普洱茶中筛选出32个差异物质，其中氨基酸类、嘌呤类、儿茶素类和没食子儿茶素类等物质在2组中的含量差异显著。[结论]建立的方法为合理科学解释普洱生茶和普洱熟茶功效提供一定的依据。

关键词普洱生茶;普洱熟茶;超高效液相色谱-高分辨质谱;代谢组学

中图分类号 TS 272.7文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）23-0226-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.059

Non-targeted Metabolomics Study for Differences in Methanol-Soluble Chemical Composition of Raw Pu-er Tea and Ripe Pu-er Tea by Using UPLC-HRMS

WANG Sheng1，2，CHEN Guan-jun1，2，ZANG Dan-dan1，2 et al

（1.The Center for Scientific Research of Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230032;2.Anhui Province Key Laboratory of Major Autoimmune Diseases，Hefei，Anhui 230032）

Abstract [Objective]To discover the methanol-soluble differential chemical compound in raw Pu-er tea and ripe Pu-er tea by a non-targeted metabolomics method based on UPLC-HRMS.[Method]After the liquid extraction，Ultra High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry （UPLC-HRMS） was used for the data acquisition.The chemical identification was carried out by comparing with the known compounds in commercial and public databases.Multivariate analysis，Mann-Whitneg U test and orthogonal projections to latent structures-discrimination analysis （OPLS-DA） analysis were used to find and visualize differential chemical compound.[Result]100 compounds were tentatively identified in raw Pu-er tea and ripe Pu-er tea.Finally，32 compounds，among which，amino acids，purines，catechins，and epigallocins，were a significant difference between them.[Conclusion]This study demonstrates the potentials and power of metabolomics method to understand the chemical secrets of Pu-er tea，which could provide a scientific explanation for the benefit of different Pu-er tea.

Key words Raw Pu-er tea;Ripe Pu-er tea;UPLC-HRMS;Metabolomics

茶是世界上消费最广泛的非酒精性饮料之一，具有巨大的经济、健康和文化价值[1]。普洱茶产自中国云南，目前常见的有普洱生茶和普洱熟茶[2-3]。普洱茶在中国有众多的消费者，相关研究表明，普洱茶具有降血脂、降血糖、抗炎和神经保护等作用，因此研究普洱茶中的化学物质及其作用机制具有很大意义和价值[2，4-5]。普洱茶是一种独特的微生物发酵茶，目前对普洱茶的相关研究报道很多，主要涉及普洱茶安全性（真菌毒素测定[6]和农药残留定量[7]等）、茶叶物质组成（靶标定量研究[8]和发酵过程中物质变化[9]等）、发酵过程菌群变化[10-11]以及茶叶的抗炎免疫药效学[12]等。

茶叶中的化学物质是构成其独特风味和功效的物质基础。普洱茶物质组成研究主要分为香气物质和非挥发性物质分析两方面。香气是普洱茶的重要品质特征，相关研究[13-15]通过气相色谱质谱法（GC-MS）发现普洱茶中的香气物质主要是醇类、酮类、酯类、酸类、醛类、醚类、陈香成分和碳氢类物质，为普洱茶的香气物质研究提供了充实的依据。普洱茶的独特口感和奇特功效也是其广受欢迎的原因，茶叶中的極性非挥发性物质发挥了重要作用。有关普洱茶中极性物质化学成分的研究很多，大多采用液相色谱（LC）或者与质谱联用（LC-MS）的方法。曾亮等[16]通过LC-MS法测定了不同贮藏时间普洱生茶水提物的特征性成分，共检测到107种化合物;朱洪波等[17]通过纯化的方法，从普洱茶水提物中分离鉴定出13种化合物;侯冬岩等[8]测定普洱生茶与普洱熟茶中原花青素含量;陈红霞等[9]对普洱茶渥堆发酵中活性成分进行靶标测定。结合相关研究总结发现，普洱茶中主要含有儿茶素类、黄酮类、生物碱类等物质，同时还有咖啡因、膳食纤维、蛋白质、维生素和矿物质等[9，18]。

单变量统计分析是最简单常用的统计学方法，常用变异倍数分析（fold change analysis，FC > 2）和t检验（P<0.05）在2组样本之间得到差异化合物，综合前面2种分析方法可以得到物质的火山图（volcano plot），来寻找潜在的差异物质[19]。

综合VIP值和火山图（图5）分析结果，得到最终的32种差异物质，采用聚类热图（图6）对2种普洱茶中差异物质进行分析[20]。

研究结果表明，普洱生茶中含有丰富的氨基酸（茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、精氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等）类物质、没食子素类、儿茶素类和槲皮素类等物质，与文献报道相符[22-23]。在普洱熟茶中，富含嘌呤类（鸟嘌呤、副黄嘌呤和次黄嘌呤）物质，研究结果和文献报道相符[9]，从非靶标代谢组学研究思路，阐明了普洱生茶和普洱熟茶重要的活性物质差异。

2.3 普洱生茶和普洱熟茶差异物质的代谢通路分析

普洱生茶发酵制成普洱熟茶，主要是普洱茶渥堆发酵过程中众多微生物发酵所致，主要涉及芽孢杆菌属、肠球菌属、青枯菌属、酵母菌和黑曲霉等[24-26]。通过非靶标代谢组学研究思路，探究出普洱生茶和普洱熟茶中差异的化学物质，利用MetaboAnalyst的通路分析功能，通过差异代谢物的KEGG ID进行通路富集分析。由图7可知，32种差异代谢物参与的代谢通路有29条。p<0.05且impact>0.2的代谢通路认为，相关性较强的通路共有2条，分别是氨酰tRNA生物合成通路（aminoacyl-tRNA biosynthesis）和丙氨酸-天门冬氨酸-谷氨酸代谢通路（alanine，aspartate and glutamate metabolism）。参与氨酰tRNA生物合成通路和丙氨酸-天门冬氨酸-谷氨酸代谢通路有10种物质，分别为天冬酰胺、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、色氨酸、酪氨酸和谷氨酸。以上研究表明，普洱生茶在渥堆发酵过程中，氨基酸类物质被微生物消耗，可能是用于微生物体内的氨酰tRNA生物合成，参与微生物的蛋白质生物合成。

3 结论与讨论

（1）采用70%甲醇提取普洱生茶和普洱熟茶后进行相关研究，该提取法主要用于提取极性较强的物质，不能很好地提取和鉴定弱极性的化合物，结合GC-MS方法可得到更加全面的物质种类信息;限于实际条件的影响，研究的普洱生茶和普洱熟茶非同一厂家生产。不同的产地、时间和制作工艺，可能会导致茶叶本身物质含量和种类存在差异;茶氨酸在普洱生茶中含量极高，但是在普洱熟茶中几乎检测不到，有关机制尚不明确。据相关文献报道，茶氨酸具有很好的抗氧化、抗肿瘤和保健等功效，有关普洱茶发酵过程中茶氨酸的转化机制有待进一步深入研究。

（2）采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪结合非靶标代谢组学研究策略，分析了普洱生茶和普洱熟茶中醇溶性差异物质种类及其相对含量。共定性出100种化合物，其中普洱生茶和普洱熟茶中有32种物质含量存在显著差异。2组茶叶中主要含有咖啡因、山萘酚、槲皮素等化学物质，普洱生茶较普洱熟茶中含有丰富的氨基酸类物质、没食子素类、儿茶素类和槲皮素类等物质;渥堆发酵得到的普洱熟茶中富含嘌呤类物质。通过差异代谢物通路富集分析，普洱熟茶中氨基酸类物质显著减少，可能是氨基酸

在普洱茶渥堆发酵过程中参与了微生物的蛋白质合成。该研究为科学合理解释普洱茶发酵工艺和茶叶功效提供了理论依据，同时也为进一步研究普洱茶提供了新的思路和方法。

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