一株广西鸡源H6亚型禽流感病毒全基因组序列分析及其重要生物学特性

李孟　谢芝勋　李丹　罗思思　谢丽基　张民秀　黄娇玲　范晴　王盛　谢志勤　邓显文　曾婷婷　张艳芳

摘要 2017年對广西地区活禽交易市场进行低致病性禽流感流行病学调查，从采集的鸡咽喉和泄殖腔拭子中分离鉴定出一株鸡源H6N6亚型禽流感病毒，命名为A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）。应用RT-PCR方法分别对分离毒株的8个基因片段进行扩增，同时将产物进行克隆和测序，然后对测序结果进行同源性比对及遗传进化分析。另外，还通过固相受体结合试验对毒株的唾液酸受体进行测定。结果显示，该分离株的 HA 基因与广东分离株A/chicken/Guangdong/G3249/2014（H6）的核苷酸同源性最高，裂解位点符合低致病性禽流感病毒的分子特征;NA基因与江西分离株A/duck/Ganzhou/GZ148/2016（H6N6）核苷酸同源性最高;内部基因中，PB1和NS基因来源于广东的鸡，PB2基因来源于越南的鸡，PA、NP和M基因来源于广西的鹅;同时，研究还发现该病毒的HA、NA、PA、NP和M基因来源H6亚型AIV，PB2、PB1和NS基因来源H9N2亚型AIV，推测A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）可能是由不同地区、不同宿主来源的H6和H9亚型 AIV通过基因重组产生的一株新的重配毒株。由于广西地理位置特殊，今后应加强对该地区H6亚型禽流感病毒变异情况的监测。

关键词 禽流感病毒;H6亚型;鸡;遗传进化;受体分析

中图分类号 S 852.65文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）23-0125-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.030

Whole Genome Sequence Analysis and Important Biological Characteristics of a Strain of H6 Subtype Avian Influenza Virus from Chicken in Guangxi

LI Meng，XIE Zhi-xun，LI Dan et al

（Guangxi Veterinary Research Institute，Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Nanning，Guangxi  530001）

Abstract In 2017，an epidemiological investigation of low-pathogenicity avian influenza was conducted in the live poultry trading market of Guangxi.One strain of H6N6 subtype of avian influenza virus was isolated and identified from throat and cloacal swab samples of chicken，named A/chicken/Guangxi / 286C10/2017（H6N6）.RT-PCR was used to amplify 8 gene fragments of isolated strains，and the products were cloned and sequenced at the same time.Then homology comparison and genetic evolution analysis were performed on the sequencing results.In addition，the sialic acid receptor of the strain was determined by solid phase receptor binding test.The results showed that HA gene in the isolated strain from Guangdong had the highest nucleotide homology with that in A/chicken/Guangdong/G3249/2014 （H6），and the  cracking sites conformed to the molecular characteristics of low pathogenic avian influenza virus.NA genes in the isolated from this strain had the highest nucleotide similarity with that in  isolated strain A/duck/Ganzhou/GZ148/2016（H6N6）.Among internal genes，PB1 and NS genes were derived from chicken in Guangdong， PB2 gene was  derived from chicken in Vietnam，and PA，NP and M genes were derived from geese in Guangxi.At the same time，we found that the HA，NA，PA，NP and M genes in this virus were from H6 subtype of AIV，PB2，PB1 and NS genes were from H9N2 subtype of AIV，and it was speculated that A/chicken/Guangxi / 286C10/2017 （H6N6） might be a new strain of H6 and H9 subtypes of AIV from different regions，different host sources by gene recombination. Due to special geographical location of Guangxi，the monitoring of the variation of H6 subtype avian influenza virus in this region should be strengthened in the future.

Key words Avian influenza virus;H6 subtype;Chicken;Genetic evolution;Receptor analysis

禽流感（avian influenza，AI）是由A型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一种动物传染性疾病。禽流感病毒基因组由8个不同的独立片段组成，其片段包括 HA、NA、PB2、 PB1、 PA、 NP、 M和NS基因[1]。同时，依据AIV对鸡的致病性，将AIV分为高致病性AIV（HPAIV）和低致病性AIV（LPAIV）[2]。1965年美国科学家从水禽样品中首次分离到H6亚型AIV[3]，目前研究已发现H6亚型AIV广泛存在于各种宿主动物并在世界各地传播[4-5];我国一些学者的研究表明，近年来我国华东和华南地区家禽中H6亚型AIV属于分离率较高的禽流感亚型之一[6-8]。同时，一些其他研究也发现某些H6亚型AIV可以跨越动物种属屏障，直接感染哺乳动物小鼠和水貂等，甚至在采集的健康人群血清中检测到抗H6亚型AIV的特异性抗体[9-11]。2013年5月，我国台湾地区首次报道了H6N1亚型AIV直接感染人的病例[12]，通过基因遗传进化分析还发现H6亚型AIV可以为感染人的H5N6、H7N9和H9N2等亚型禽流感病毒提供内部基因[13-15]。以上研究结果表明，H6亚型AIV存在潜在的直接感染哺乳动物和人的可能性，且严重威胁到人类的公共卫生安全。

笔者所在实验室自2009年以来一直对广西地区活禽交易市场进行AIV流行病学监测，已经从表观健康的家禽体内分离到多株不同HA和NA组合的H6亚型AIV[16]。由于H6亚型AIV经常与H5、H9等亚型AIV同时存在于家禽体内，当不同亚型AIV同时感染一只家禽时，就大大增加了流感病毒基因重排的概率，为产生新的禽流感病毒株创造了便利条件。广西处于华南“流感中心”，且与禽流感疫情十分复杂的越南山水相连，同时还处在候鸟迁徙路线上，地理位置十分特殊。笔者于2017年从广西活禽市场分离到1株具有代表性的鸡源H6N6病毒，进行全基因组测序并分析其遗传演化情况，同时对部分重要生物学特性进行了测定，以期了解H6亚型AIV在广西地区的遗传进化及变异情况，为该亚型禽流感病毒的研究和防控提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品与鸡胚。

2017年从广西地区某活禽交易市场采集表观健康鸡群的咽喉和泄殖腔棉拭子，置于含有4种抗生素的保存液中，低温运输至广西兽医生物技术重点实验室进行病毒分离和鉴定。9～11日胚龄SPF鸡胚，购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂。DNA/RNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒、感受态细胞、PCR产物快速连接载体和DNA Marker均购自北京全式金生物技术有限公司;高保真2× PCR Mix、随机引物、dNTP、MLV 反转录酶和RNA酶抑制剂均购自宝生物工程（北京）有限公司;6′-Sialyllactose-PAA-biotin（6′SL-PAA）和3′-Sialyllactose-PAA-biotin（3′SL-PAA）购自GlycoTech公司;TMD底物溶液购自北京天根生物科技有限公司;Streptavidin-HRP购自美国R&D systems公司;其余试剂购自商业公司，均为国产分析纯。

1.1.3 引物设计及合成。参照文献[17]及GenBank中收录的相关H6亚型AIV的全基因序列，利用 Primer Premier 和Oligo软件设计多对A型流感病毒基因组8个节段的引物，用于扩增A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）全基因，引物由南寧捷瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分离、鉴定及空斑纯化。将不同活禽交易市场现场采集的鸡群棉拭子样品低温快速转运至实验室处理，经离心取上清液接种于10日胚龄SPF鸡胚尿囊腔，每个样品接种2枚鸡胚，0.2 mL/枚，37  ℃孵化96 h;收获24 h后死亡和未死亡的鸡胚尿囊液，分别采用血凝试验（HA）和血凝抑制（HI）试验进行鉴定，用针对H1～H16亚型AIV以及新城疫病毒的多抗血清对具有HA效价的样品进行HI试验，初步确定样品的HA亚型。将HI试验确定为H6亚型AIV病毒株尿囊液接种于鸡胚成纤维细胞（CEF），通过空斑纯化的方法进行连续3轮的克隆纯化，再接种SPF鸡胚对纯化的毒株进行增殖，将收获尿囊液经HI试验鉴定后，-80 ℃下保存备用。

1.2.2 病毒RNA提取与RT-PCR扩增。

取经空斑纯化后增殖的病毒尿囊液，使用RNA 抽提试剂盒按照使用说明书提取其病毒总RNA，利用流感病毒Uni-12通用引物及反转录酶按照其使用说明书进行cDNA合成。根据不同的基因引物设计不同的PCR程序，分别对各基因片段进行扩增。PCR扩增产物利用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3 PCR产物的回收纯化及克隆测序。

将目的片段从琼脂糖凝胶切下后，按照胶回收试剂盒说明书进行回收纯化，然后与快速克隆载体进行连接后转化至感受态细胞中，涂板培养后挑取单个菌落进行菌液PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的菌液送交深圳华大基因（广州）公司进行序列测序。

1.2.4 序列比对及遗传进化分析。利用DNASTAR软件对毒株各基因测序结果进行比对和整理，并将比对结果与NCBI网站中的相关参考毒株进行分析。同时，选择一些具有代表性的参考毒株基因序列及不同宿主来源的H6亚型AIV基因序列，应用MEGA6.0软件对分离株和参考株的各基因进行比对，并构建其遗传进化树，进而分析分离毒株的遗传演化情况。

1.2.5 分离株受体亲和特性的测定。根据病毒的HA效价，用包被缓冲液将分离毒株尿囊液稀释至7log2，将准备好的病毒液100 μL/孔加入96孔ELISA板，放置4 ℃冰箱中包被过夜，设置空白对照;将6′SL-PAA及3′SL-PAA分别设置4个不同的稀释梯度，每个稀释梯度设3个重复，病毒和受体反应终止后，用酶标仪读取样品在450 nm波长处的吸光值。

2 结果与分析

2.1 病毒的分离鉴定及纯化结果 收集HA试验效价大于或等于4log2的鸡胚尿囊液样品，进行HI试验。编号为286C10样品的尿囊液HI试验结果表明，其仅与H6亚型AIV抗血清发生作用，而与其他HA亚型AIV和新城疫病毒抗血清不存在任何交叉作用，其结果初步确定该分离株为H6亚型AIV。该毒株的尿囊液接种于CEF细胞上，经过3轮的空斑纯化后，经过SPF鸡胚增殖，通过HA试验测得其效价为26。同时，通过HI试验测定其对抗H6亚型AIV阳性血清的HI效价为8log2。

2.2 病毒全基因RT-PCR扩增及克隆测序结果

RT-PCR扩增均得到与引物设计预期大小相符的目的基因条带。各目的基因经克隆和PCR鉴定成功后测序，测序结果用DNAStar软件进行比对，将拼接后的基因序列进行同源性BLAST比对分析。比对结果表明，HA和NA基因与H6及N6亚型AIV的核苷酸同源性最高。因此，将该分离毒株命名为A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）。

2.3 分离株各基因片段的序列比对及遗传进化分析

各个基因经过比对拼接形成病毒的全基因序列，各片段与GenBank中核苷酸同源性最高的病毒株进行BLAST分析，分析结果见表1。A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6） HA基因比对结果与广东鸡源分离株A/chicken/Guangdong/G3249/2014（H6） 相似性最高，核苷酸同源性为98.53%。序列分析结果表明，其HA 基因开放阅读框（ORF）全长1 701 bp。HA1和HA2蛋白裂解位点不存在3个以上连续的碱性氨基酸，具有低致病性AIV的分子特征。HA受体结合位点第226（参照H3亚型编号）位氨基酸未发生Q226L突变。HA基因遗传进化树分析表明，该毒株属于欧亚进化谱系的ST339-like分支，与北美分支H6病毒株有一定的遗传距离（图1）。NA基因的ORF全长为1 413 bp，与A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）的NA基因核苷酸同源性最高的毒株为江西分离株A/duck/Ganzhou/GZ148/2016（H6N6），核苷酸同源性为98.80%。PB2基因的ORF全长为2 280 bp，与 A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）的PB2基因核苷酸同源性最高的毒株为越南分离株 A/chicken/Vietnam/H7F-14-BN4-339/2014（H9N2），核苷酸同源性为99.25%。PB1基因的ORF全长为2 274 bp，与 PB1 基因核苷酸同源性最高的毒株是广东分离株A/chicken/Shenzhen/1377/2013（H9N2），核苷酸同源性为96.26%。PA基因编码区全长为2 151 bp，同源性最高的毒株为A/goose/Guangxi/128/2013（H6N2），核苷酸同源性为98.47%。NP基因编码区全长为1 497 bp，与其核苷酸同源性最高的毒株是 A/goose/Guangxi/128/2013（H6N2），核苷酸同源性为 98.13%。M 基因编码区全长982 bp，与M基因核苷酸同源性最高的毒株为A/goose/Guangxi/128/2013（H6N2），核苷酸同源性为99.12%。NS基因编码区全长838 bp，核苷酸同源性最高的毒株为 A/chicken/Guangdong/SIC41/2015（H9N2），核苷酸同源性为99.55%。

2.4 受体亲和性测定结果 通过酶联免疫吸附试验对纯化的毒株进行了受体结合特异性的测定，结果表明分离毒株虽然优先选择与SAα2，3受体结合，但也同时具有与SAα2，6受体的亲和特性，但结合能力存在差异（其与α-2，3唾液酸受体结合能力稍强，见图2），表明该鸡源H6N6 AIV 同时具备与α-2，3和α-2，6唾液酸受体结合的特性，具有潜在的感染人的风险。

3 讨论

AIV由于亚型众多，极易发生變异和重组，研究表明部分亚型AIV能够跨越种属屏障感染直接感染哺乳动物和人，不但给全球养禽业造成严重的经济损失，而且还会威胁到人类公共卫生安全[18]。高致病性H5和H7亚型AIV及低致病性的H9亚型AIV分别因其对家禽的高致死率及在家禽中的广泛流行而受到人们的普遍关注[19]。低致病性的H6亚型AIV虽然在自然界中普遍存在，但由于其一般不引起宿主产生明显的临床症状和死亡，因而一直没有引起人们对它的重视。2014年5月在我国四川地区首次出现人感染H5N6亚型 AIV 病例，通过对毒株基因组分析发现该病毒的NA基因片段来自禽源H6N6亚型病毒[20]。另外，有报道利用血清学调查的方法在美国和中国的健康人群中发现了一定比例的H6亚型AIV抗体阳性人员[21]。因此，H6亚型AIV引起的公共卫生安全问题已经越来越引起人们的重视。

广西地处我国华南地区，同时又处于全球8大候鸟迁徙路线之一的东亚和澳大利亚线路上，每年都有大量迁徙的候鸟途经此地。此外，广西是全国的养禽大省，与广东等省份有着频繁的活禽贸易往来，还与流感疫情复杂的越南相邻，加上广西地区人口稠密，活禽市场遍布城乡，水禽养殖规模大，且有放养畜禽的习惯，人与家禽、野鸟和候鸟的生活空间高度重叠，密切接触，这些都为流感病毒变异株或新亚型AIV的产生创造了理想的条件，严重威胁畜牧业和公共卫生的安全。当不同亚型和不同宿主来源的AIV在感染同一宿主或细胞时，病毒可以通过交换某些基因片段发生基因重排，进而产生新的子代重配病毒，研究也表明自然界往往会发生多重AIV重组[22-23]。通过对鸡源A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6） 病毒的全部基因组序列进行分析以及与其他亚型病毒株的比较显示，该研究中的病毒基因组的序列来源可能各不相同：HA、PB1和NS基因来源于广东的鸡，NA基因来源于江西的鸭，PB2基因来源于越南的鸡，PA、NP和M基因来源于广西的鹅;同时研究还发现该病毒的HA、NA、PA、NP和M基因来源H6亚型AIV，PB2、PB1和NS基因基因来源H9N2亚型AIV，推测A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）可能是由不同地区不同宿主来源的H6和H9亚型 AIV通过基因重组产生的一株新的重配毒株，由此可见该病毒基因来源的复杂性。正是因为复杂来源及重配导致目前AIV毒株的生物学特性也变得日益复杂化，同时也给AI 的科学综合防控造成新的难题。

已有的研究发现禽流感病毒HA蛋白某些受体结合位点的特异性可以决定该病毒感染的宿主范围[24]，A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）HA基因的226位受体结合位点没有由Q变异为L，说明该毒株存在与哺乳动物受体结合的潜在可能性较小。该研究中AIV受体结合试验的结果也显示A/chicken/Guangxi/286C10/2017（H6N6）具备与α-2，6唾液酸受体结合的特性（即跨越种属屏障感染哺乳动物），该毒株其他相关的生物学特性有待进一步深入研究和验证。近年来的流行病学调查结果显示，家禽中H6N6亚型AIV的分离率逐渐升高，H6N6亚型AIV极易与其他亚型的禽流感病毒在宿主体内发生基因重配进而形成新的流感病毒重组毒株或变异株，对畜牧业健康发展和对人类公共卫生安全构成严重的威胁。因此，深入研究H6N6 AIV的起源、进化和生物学特性等的变化对H6亚型禽流感病毒的科学防控具有重要意义。

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基金项目 广西科技重大专项（桂科AA17204057）;广西科技基地和人才专项项目（桂科AD17195083）;广西“八桂学者”专项 （2019-79）;国家“万人计划”领军人才专项（2016-37-88）。

作者简介 李孟（1981—），男，河南南阳人，副研究员，博士，从事病原分子生物学研究。*通信作者，研究员，从事预防兽医学研究。

收稿日期 2020-03-22