壶瓶碎米荠粗黄酮提取工艺优化及硒对粗黄酮含量和成分的影响

牛茵茵，何雪梅，冉秉钦，唐巧玉，周大寨，罗兴武，罗凯，周毅峰

(1.生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000；2，湖北民族大学生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)

壶瓶碎米荠(Cardaminehupingshanensis)，十字花科[1].叶片的形状是圆心形，叶片边缘的形状是齿状[2].生长在海拔800～1 400 m的山坡林下,沟边、阴暗潮湿或有清质水流的环境[3].用HPLC-ICP-MS测得壶瓶碎米荠幼叶硒含量高达1 427 mg/kg[4]，含硒量在1 000～15 000 mg/kg之间的植物称之为超聚硒植物，故壶瓶碎米荠是超聚硒植物[5].由于壶瓶碎米荠高度聚硒，且全株可食，近年来对壶瓶碎米荠的研究也逐步增多，它可以将无机硒转化为硒氨基酸，硒多糖等大分子物质，在适量的条件下，可以参与机体抗氧化，作用某些癌症等功能，是安全、稳定、低毒补硒剂的首选，在食品和保健品行业中有很大的发展前景.且壶瓶碎米荠中含有黄酮类化合物，该物质多呈游离态和糖结合成苷的形式存在[6-7]，是抗心血管病药物，具有扩血管、抗凝血作用[8-12].此外，黄酮类化合物在食品，疾病防治、人工合成，甚至分子生物学、植物转化等方面都具有一定的研究规模.它具有很高的药理作用及开发价值,成为未来医药、食品领域的研究热点[13-14].而目前对于壶瓶碎米荠的研究主要涉及大分子物质(硒蛋白，硒多糖等)的提取和相关成分的理化性质，以及对硒的耐受调控机制等方面.缺少硒对粗黄酮含量以及壶瓶碎米荠不同部位黄酮类化合物成分等的影响研究[15].我们的研究采用湖北省武陵山区的壶瓶碎米荠，旨在通过前处理获得不同质量浓度硒的材料，应用正交试验法提取壶瓶碎米荠中的黄酮，得到优化壶瓶碎米荠粗黄酮提取条件，进行LC-MS(液相色谱-质谱联用)，并分析壶瓶碎米荠叶和根黄酮成分差异，利用双道原子荧光光度计测定壶瓶碎米荠黄酮中的硒含量，为壶瓶碎米荠的开发利用提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试壶瓶碎米荠种子来自湖北省恩施市鱼塘坝，芦丁(标准品)，亚硒酸钠，5%亚硝酸钠，10%硝酸铝，4%氢氧化钠，无水乙醇，硼酸，过氧化氢，盐酸,乙二胺四乙酸二铁(EDTA-Fe)、甲醇、四水合硝酸钙、碘化钾、五水合硫酸铜、六水合氯化钴、二水合锰酸钠、七水合硫酸锌等分析纯试剂.

JA2003N电子分析天秤，GZX-9420MBE数显鼓风干燥箱，WFJ 7200型可见分光光度计，HWS 12型电热恒温水浴锅，Eppendorf 5418冷冻高速离心机，KQ5200B超声波清洗机，MARS 5微波消解仪，AFS-9760双道原子荧光光度计，RE-2000A旋转蒸发仪，高通量组织研磨仪.HPLC(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM20A system)，MS(Applied Biosystems 4000 Q-TRAP)，真空冷冻干燥器(alpha 2-4 lsc)，FitMax针头式过滤器(0.22 μm)，涡旋振荡器，GZX-9420MBE电热恒温鼓风干燥箱.

1.2 试验方法

1.2.1 供试样品

1.2.1.1 粗黄酮提取样品 材料选取经质量浓度为50 μg/mL硒处理的壶瓶碎米荠，将处理后的样品60 ℃烘干，粉碎备用.

1.2.1.2 硒样品处理 选取硒处理质量浓度范围为0～100 μg/mL，质量浓度间隔10 μg/mL，在加硒(亚硒酸钠(Na2SeO3))培养液中处理壶瓶碎米荠7 d，以不加硒为对照组，每隔48 h更换一次含硒培养液，每个处理3个生物学重复，每个重复由3株苗混合组成，7 d后取样.60 ℃烘干样品，高通量研磨仪粉碎样品.

1.2.1.3 黄酮种类和样品差异分析 80 μg/mL硒胁迫壶瓶碎米荠处理10 d，以不加硒处理的壶瓶碎米荠为对照组.16 h白昼，8 h黑夜，20 ℃培养.待壶瓶

碎米荠的根部大量变红时，分成叶和根分别取样.每个生物学重复取自于5个不同植株，各样取3个生物学重复.液氮速冻，真空冷冻干燥，-80 ℃保存.

1.2.2 粗黄酮的提取方法及工艺优化 本研究采用超声辅助提取法(480 W).4个不同因素，设计单因素试验[14-15](表1)，根据单因素试验结果设计L9(34)正交试验(表2).准确称取壶瓶碎米荠叶片1 g于250 mL圆底烧瓶，超声破碎40 min,间隔10 min摇晃一次(为了破碎充分后恒温水浴锅水浴)，定容到100 mL.4 000 r/min的离心机离心20 min.用Φ=0.25 μm的滤纸过滤取上清液待测.

表1 单因素设计

表2 正交试验因素水平表

1.2.3 粗黄酮含量及粗黄酮硒含量测定 壶瓶碎米荠粗黄酮提取按上述优化工艺进行，按田国政等[16]的分光光度法进行黄酮含量的测定.

式中，A为吸光值;100为样液定容总体积/mL;2为测定吸光度用样液的体积/mL;1为壶瓶碎米荠样品质量/g，提取率保留小数点后4位.按张春燕等[19]的方法进行样品的消解和硒含量的测定.

1.2.4 黄酮成分分析 壶瓶碎米荠根和叶的样品经过真空冷冻干燥之后，研磨仪研磨(30 Hz，90 s).然后称取100 mg粉末，加入70%甲醇用来提取水溶性代谢产物，每隔10 min漩涡混匀一次，共3次，随后放入4 ℃过夜(是为了提取更充分).将样品在10 000g转速、4 ℃下离心10 min，取上清，利用微孔滤膜(SCAA-104，0.22 μm)对样品进行过滤，过滤后的样品进行LC-MS分析.

LC-MS条件：色谱柱，shim-pack VP-ODS C18(pore size 5.0 μm，length 2×150 mm).流动相，水相为超纯水(加入0.04%的乙酸)，有机相为乙腈(加入0.04%的乙酸).洗脱梯度，水∶乙腈，0 min为95∶5 V/V，20.0 min为5∶95V/V，22.0 min为5∶95V/V，22.1 min为95∶5V/V，28.0 min为95∶5V/V.流速为0.25 mL/min.柱温为40 ℃.进样量为2 μL.

Q-TRAP-MS/MS：ESI源的电喷雾离子源温度为550 ℃，IS为5 500 V，GS1、GSII以及CUR分别为3.1×105Pa、3.45×105Pa、1.75×105Pa，CAD设置为高.

1.3 数据统计与分析

使用Excel、SPSS、Origin 9.0软件进行数据的误差分析和t值检验，进行平行组的平均值矫正和显著性差异分析.此外使用Multiquant软件对黄酮物质测定结果进行分析，根据标准曲线计算出峰面积和黄酮含量.将同一物质的含量导入SIMCA-P 13.0进行数据分析，采用主成分分析(Principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法判别分析( orthogonal to partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA) 对数据进行离群样本判断、聚类以及模型的判别分析，为了验证模型的可靠性，防止试验结果发生过拟合，采取OPLS-DA进行交叉验证.通过OPLS-DA的载荷图和模型的变量重要性因子(variable importance factor，VIP),以及两个独立样品的方差分析(analysis of variance，ANOVA) 寻找黄酮差异，利用韦恩图研究壶瓶碎米荠硒胁迫影响黄酮类代谢物的变化.

2 结果与分析

2.1 粗黄酮提取工艺优化

2.1.1 单因素试验结果分析 优化黄酮的提取工

艺，选择乙醇为提取溶剂，50 μg/mL硒处理的壶瓶碎米荠为材料，研究乙醇体积分数、料液比、提取温度和时间4个单因素对黄酮提取率的影响，结果见图1.由图1-A可以看出，当乙醇体积分数为40%～50%时，黄酮提取率极显著上升,体积分数为50%～70%时，黄酮提取率极显著下降，可能是由于乙醇体积分数过大时会对所提取出的黄酮产生降解作用，在体积分数70%～90%时，没有显著变化.由此可见，不同体积分数乙醇对壶瓶碎米荠的黄酮提取率影响不同，其中50%的乙醇使黄酮提取率达到最高峰，值为3.09%.由图1-B发现，1∶10～1∶30料液比黄酮提取率没有显著上升，1∶30～1∶40料液比黄酮提取率出现极显著下降，1∶40～1∶50料液比黄酮提取率没有显著性的变化.由此可见，不同料液比对壶瓶碎米荠的黄酮提取率影响不同，其中1∶30使黄酮提取率达到最高峰，值为1.68%.由图1-C发现，55～75 ℃黄酮提取率出现极显著上升，85～95 ℃黄酮提取率出现极显著下降，原因可能是温度升高时，分子的碰撞运动加剧对其结构产生影响[20]，与此同时会使杂质含量升高，最终导致黄酮提取率下降.由此可见，不同提取温度对壶瓶碎米荠的黄酮提取率影响不同，其中75 ℃黄酮提取率达到最高峰，值为2.07%.由图1-D发现，1～3 h黄酮提取率有显著上升，3～4 h黄酮提取极显著上升，4～5 h黄酮提取率出现显著下降，这是由于提取时间过长时，会破坏黄酮的结构.所以当提取时间为4 h时，黄酮提取率达到最高为1.69%.

大写字母表示显著差异，α=0.05，小写字母表示极显著差异，α=0.01.Capital letters indicate a significant difference,α=0.05,lowercase letters indicate a very significant difference,α=0.01.图1 单因素对壶瓶碎米荠粗黄酮提取率的影响Figure 1 The effect of extraction single factor on the extraction rate of flavonoids from Cardamine hupingshanensis

2.1.2 正交试验结果分析 为进一步探索黄酮的提取工艺，选用的材料是质量浓度为50 μg/mL硒处理的壶瓶碎米荠，通过正交试验提取后D510测吸光度取3组平均值.试验结果见表3.结果表明，影响黄酮提取率的主次顺序为D>B>C>A，黄酮提取率高达1.897 6%.试验得出提取最佳工艺各项指标分别为5 h、65 ℃、1∶20料液比、乙醇体积分数45%，在此种条件下经试验结果验证黄酮提取率达到1.902 5%.由表4可得，F乙醇体积分数>F0.05(2,2).乙醇体积分数发生了显著性的变化，说明乙醇体积分数对硒处理壶瓶碎米荠叶黄酮提取的影响最大.

2.2 硒对壶瓶碎米荠中黄酮及其硒含量的影响

2.2.1 硒对壶瓶碎米荠中黄酮提取率的影响 为研究硒对壶瓶碎米荠黄酮含量的影响，选取硒处理质量浓度范围为0～100 μg/mL，质量浓度间隔为10 μg/mL，在培养液中加入硒处理7 d的壶瓶碎米荠为材料进行研究，结果见图2，当硒质量浓度为50 μg/mL时，黄酮提取率达1.902 5%.硒处理壶瓶碎米荠的质量浓度在0～30 μg/mL黄酮提取率没有显著性的上升；硒质量浓度在30～50 μg/mL时，黄酮提取率有极显著的上升；硒质量浓度在50～80 μg/mL时，黄酮提取率有极显著的下降；硒质量浓度在80～100 μg/mL时，黄酮提取率没有显著性的变化.硒质量浓度在0～50 μg/mL时，黄酮提取率呈极显著的上升，即硒质量浓度在0～50 μg/mL区间时，黄酮提取率随硒质量浓度的增加而升高；硒质量浓度在50～100 μg/mL时，黄酮提取率有极显著的下降，即随硒质量浓度的增加导致黄酮提取率降低.

2.2.2 硒处理壶瓶碎米荠中黄酮的含硒量 为进一步探索硒对壶瓶碎米荠的黄酮中含硒量的影响，选取硒处理质量浓度范围为0～100 μg/mL，质量浓度间隔10 μg/mL，在培养液中加硒处理7 d的壶瓶碎米荠为材料进行研究，结果见图3.硒质量浓度为0 μg/mL处理壶瓶碎米荠叶后提取黄酮，黄酮中硒含量为0.012 6 mg/g，用质量浓度为40 μg/mL硒处理壶瓶碎米荠叶后提取黄酮，黄酮中硒含量为0.519 0 mg/g，用质量浓度为70 μg/mL硒处理壶瓶碎米荠叶后提取黄酮，黄酮中硒含量为10.097 6 mg/g，用质量浓度为100 μg/mL硒处理壶瓶碎米荠叶后提取黄酮，黄酮中硒含量为50.763 6 mg/g.处理壶瓶碎米荠叶后提取黄酮的硒质量浓度在0～20 μg/mL和30～40 μg/mL时没有显著性的变化；处理壶瓶碎米荠叶后提取黄酮的硒质量浓度在20～30 μg/mL、40～100 μg/mL时黄酮中硒含量有极显著的上升，总体呈上升趋势.

表3 正交试验结果与极差分析

表4 正交试验方差分析表

大写字母表示显著差异，α=0.05，小写字母表示极显著差异，α=0.01.Capital letters indicate a significant difference,α=0.05,lowercase letters indicate a very significant difference,α=0.01.图2 壶瓶碎米荠叶中粗黄酮的提取率Figure 2 The extraction rate of crude flavonoids in the leaves of Cardamine hupingshanensis

大写字母表示显著差异，α=0.05，小写字母表示极显著差异，α=0.01.Capital letters indicate a significant difference,α=0.05,lowercase letters indicate a very significant difference,α=0.01.图3 壶瓶碎米荠叶中粗黄酮的含硒量Figure 3 The selenium content of crude flavonoids in lthe eaves of Cardamine hupingshanensis

2.3 壶瓶碎米荠黄酮差异成分分析

为了研究硒处理对壶瓶碎米荠黄酮成分的影响，选用在实验室进行10 d硒胁迫(80 μg/mL)处理的壶瓶碎米荠为材料，以不加硒(0 μg/mL)为对照组进行研究，通过UPLC- Q-TRAP/MS检测到壶瓶碎米荠黄酮物质有131种.运用SIMCA-P 13.0软件对壶瓶碎米荠黄酮含量进行分析，结果如图4.同组的生物学重复之间距离较近，差异较小，生物学重复分别紧密聚集.各组之间的差异较为明显，平均分布于两个象限中.壶瓶碎米荠叶片中黄酮变化如下：壶瓶碎米荠在80 μg/mL硒质量浓度处理下，有11种物质发生了显著变化，其中有3种出现极显著差异，其他物质含量变化都不显著.壶瓶碎米荠根部黄酮变化如下：壶瓶碎米荠在80 μg/mL硒质量浓度处理下，有8种物质发生了显著性变化，其中有3种出现极显著差异，其他物质含量变化都不显著.根据黄酮糖基化的方式不同，可以将测定得到的黄酮分为3类，分别为C糖、O糖和PMFs(多甲氧基黄酮)，C连接的有61种，PMFs只有7种，O连接的黄酮占48.1%.

2.3.1 壶瓶碎米荠叶片黄酮差异分析 为比较两种处理壶瓶碎米荠叶片黄酮的主效成分(选取含量占总含量1%以上的黄酮为主效成分)的差异，对其做韦恩图，见图5.壶瓶碎米荠叶片黄酮的主效成分的差异如下：木犀草素 C-sinapoyl己糖苷在高硒处理后含量显著提高，说明高硒会对其形成某种促进作用.单宁、五甲氧基黄酮、木犀草素 7-O-糖苷、山奈酚、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和5，7-二羟基-2-苯并吡喃-4-酮 5-O-己糖苷衍生物在高硒处理后含量减少，说明高硒会抑制壶瓶碎米荠叶部产生这6种物质.

1和2分别表示对照壶瓶碎米荠叶和根的生物学重复，3和4分别表示高硒处理壶瓶碎米荠叶和根的生物学重复.The number 1 and 2 represent three biological repetition of leaves and roots control samples,3 and 4 represent three biological repetition of leaves and roots selenium treated samples of Cardamine hupingshanensis,respectively.图4 壶瓶碎米荠不同质量浓度硒处理黄酮PCA-X得分图Figure 4 The PCA-X score of flavonoids in Cardamine hupingshanensis by various concentrations of selenium

图5 壶瓶碎米荠叶片黄酮主效成分韦恩图Figure 5 The Wayne diagram of flavonoids in the leaf of Cardamine hupingshanensis

为更进一步研究硒处理对壶瓶碎米荠叶片黄酮的影响，选取含量占总含量1%以上的黄酮为主效成分.结果见表5.壶瓶碎米荠0 μg/mL硒质量浓度处理下叶片黄酮主效成分有7种，占总量的93.49%，含量最高的是单宁，占总含量的52.766 5%，次之是五甲氧基黄酮，二者含量百分比均大于20%.壶瓶碎米荠80 μg/mL硒质量浓度处理下叶片黄酮主效成分含量最高的是单宁，占总含量的42.804 1%，7种主效成分含量占总含量的94.09%，次之是五甲氧基黄酮，二者含量百分比均大于20%.

2.3.2 壶瓶碎米荠根部黄酮差异分析 为比较两种处理壶瓶碎米荠根部黄酮的主效成分的差异，对其做韦恩图，见图6.壶瓶碎米荠根部黄酮的主效成分的差异如下：木犀草素7-O-糖苷和山奈酚在加硒情况下，含量都没有显著变化，说明该物质只受壶瓶碎米荠自身的调控，受硒影响较小.五甲氧基黄酮在壶瓶碎米荠加硒时含量增加，说明高质量浓度硒能够促进其生成.木犀草素7-O-糖苷和山奈酚在高硒处理后含量都没有显著变化，单宁和5，7-二羟基-2-苯并吡喃-4-酮5-O-己糖苷衍生物在高硒处理后含量会显著下降，说明硒会抑制壶瓶碎米荠根部产生这两种物质.

图6 壶瓶碎米荠根部黄酮主效成分韦恩图Figure 6 The Wayne diagram of flavonoids in the root of Cardamine hupingshanensis

表5 壶瓶碎米荠不同质量浓度硒处理下叶片黄酮主效成分

为更进一步研究硒处理对壶瓶碎米荠根部黄酮的影响，选取含量占总含量1%以上的黄酮为主效成分.结果见表6.壶瓶碎米荠经0 μg/mL硒质量浓度处理后根部黄酮主效成分有5种，占总含量的94.89%，含量最高的是五甲氧基黄酮，占总含量的72.673 6%.壶瓶碎米荠经质量浓度80 μg/mL硒处理后根部黄酮有3种，含量百分比达到91.43%，含量最高的3种黄酮差异较大，五甲氧基黄酮的含量高达79.968 3%，是木犀草素 7-O-糖苷的13倍，是山奈酚的14倍.

表6 壶瓶碎米荠不同质量浓度硒处理下根部黄酮主效成分

3 讨论与结论

壶瓶碎米荠适宜生长在富硒土壤中，属超聚硒植物，在最佳工艺条件下(5 h、65 ℃、1∶20料液比、体积分数45%乙醇)提取黄酮，最高黄酮提取率达到1.902 5%，此研究结果对提高壶瓶碎米荠的开发利用价值以及应用范围有所帮助，同时也为开发更多保健功能的含硒新产品提供参考；此外测定其硒含量，结果表明黄酮提取率和黄酮中的硒含量在硒质量浓度为0～50 μg/mL时呈上升趋势，超过50 μg/mL后黄酮提取率呈下降趋势，而黄酮中硒含量呈上升趋势，可能是因为植物受到硒胁迫后，植物体内次生代谢产物情况发生变化，也可能与硒的转运和代谢机制有关，笔者认为需进一步探索.经过黄酮成分差异分析发现，高质量浓度硒处理壶瓶碎米荠发现对其根和叶中的黄酮成分影响不同.高硒促进五甲氧基黄酮在壶瓶碎米荠根部的表达，高硒会抑制单宁和5，7-二羟基-2-苯并吡喃-4-酮 5-O-己糖苷衍生物在壶瓶碎米荠根部的表达.高硒促进木犀草素 C-sinapoyl己糖苷在壶瓶碎米荠叶片的表达，高硒会抑制单宁、五甲氧基黄酮、木犀草素 7-O-糖苷、山奈酚、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和5，7-二羟基-2-苯并吡喃-4-酮 5-O-己糖苷衍生物在壶瓶碎米荠叶片中的表达.这些黄酮类物质在壶瓶碎米荠根部和叶片中的表达受到抑制或者促进，它们是通过哪些途径或酶产生的影响，其中哪些合成代谢基因产生了影响都需要进一步研究.为了提高硒资源和硒产品的开发，笔者认为对富硒黄酮在酒精中的复溶性以及硒原子在黄酮上的结合位点应进一步研究.