新生儿听力筛查联合PCR-导流杂交技术在遗传性非综合征型耳聋患儿筛查中的应用

苏炳森，苏小杰，成立松，吴柳英

广东省中山火炬开发区医院：1.检验科；2.产科，广东中山 528437

耳聋是由听觉传导通路发生器质性或功能性病变导致，每年有1/1 000～3/1 000的新生儿为耳聋患儿，耳聋还会导致语言障碍，对患儿及其家庭造成严重影响[1]。耳聋患者60%以上为遗传性耳聋，而60%～70%的遗传性耳聋为遗传性非综合征型耳聋[2-3]。遗传性非综合征型耳聋发病原因为基因组异常导致听力功能障碍，但未合并其他系统异常，临床上以GJB2基因、GJB3基因、sLc26A4基因、mtDNA基因突变最为常见。听力筛查可早期诊断新生儿耳聋，但筛查未通过的新生儿需要在3个月后再进行听力诊断，可能导致患儿错过最佳治疗时机。PCR-导流杂交技术具有操作简单、价格便宜、高通量等优点，是耳聋基因突变检测的新方法，可一次性检测4个耳聋基因的9个突变位点[4]。本文以新生儿作为研究对象，分析自动听性脑干反应法(AABR)+耳声发射法(OAE)、PCR-导流杂交技术对新生儿耳聋的筛查结果，比较听力筛查结果为耳聋的患儿和正常听力新生儿的耳聋基因检出率，分析GJB2基因、GJB3基因、sLc26A4基因、mtDNA基因的9个突变位点在耳聋患儿和正常听力新生儿中的分布情况，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年4—11月于本院出生的2 145例新生儿作为研究对象，其中男1 098例，女1 047例；出生体质量2 758～4 367 g，平均(3 438.83±588.48)g。本研究经本院伦理委员会批准，患儿家属签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1听力筛查 采用AABR+OAE在新生儿出生2 d时进行听力初筛，未通过者在出生42 d时行听力复查，仍未通过者在出生3个月时行听力诊断性检查，确定是否为耳聋。

1.2.2PCR-导流杂交技术 抽取100 μL全血进行抗凝处理，采用潮州凯普生物化学有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA。从数据库中选取GJB2基因、GJB3基因、sLc26A4基因、mtDNA基因序列，设计4对引物，对GJB2基因35delG、176del16、235delC、299delAT，GJB3基因538C>T，sLc26A4基因2168A>G、IVS7-2A>G，mtDNA基因1494C>T、1555A>G共9个突变位点进行扩增。取2 μL提取好的DNA标本作为模板，取28 μL扩增试剂，一同加入PCR反应管中进行PCR扩增。扩增条件：95 ℃ 9 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环40次；72 ℃ 5 min，16 ℃ 10 s。将PCR产物于95 ℃变性5～10 min，冰水浴2 min。进行膜条杂交，准备好杂交仪后，加入已变性的PCR产物DNA到已预热至45 ℃的0.8 mL杂交液中，混匀，进行20 min导流杂交。然后用45 ℃的洗脱液冲洗膜3～4次，每次间隔5 s，每次0.8 mL；调整温度为25 ℃，用0.5 mL封阻液封闭膜，重复1次。加入0.5 mL酶标液，温育5 min；调整温度至35 ℃，用溶液A(2×枸櫞酸钠缓冲液、0.1%十二烷基磺酸钠)彻底洗膜4次，每次0.8 mL。加入0.5 mL显色液，显色6 min；用杂交液洗膜3次，每次0.8 mL，再用2.0 mL蒸馏水漂洗，1 h内分析结果。

1.3观察指标 分析AABR+OAE筛查结果；比较耳聋患儿与正常听力新生儿的耳聋基因检出率；比较GJB2基因35delG、176del16、235delC、299delAT，GJB3基因538C>T，sLc26A4基因2168A>G、IVS7-2A>G，mtDNA基因1494C>T、1555A>G 9个突变位点在耳聋患儿和正常听力新生儿中的分布情况。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0软件进行数据分析。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1AABR+OAE筛查结果 2 145例新生儿中，有2 106例通过筛查，为正常听力新生儿；有39例(1.82%)未通过筛查，在行听力诊断性检查中判定为耳聋，其中轻度、中度、中重度、重度耳聋分别为7、11、13、8例。

2.2耳聋患儿与正常听力新生儿的耳聋基因检测结果比较 39例耳聋患儿中共检出9例患儿携带耳聋基因，检出率为23.08%，正常听力新生儿中共检出66例携带耳聋基因，构成比为3.13%，耳聋患儿耳聋基因检出率高于正常听力新生儿(χ2=45.134，P<0.001)。

2.3耳聋基因突变位点在耳聋患儿与正常听力新生儿中的分布情况比较 耳聋基因中，GJB2基因235delC突变位点构成比最高，占52.00%(39/75)。耳聋患儿与正常听力新生儿GJB2基因35delG、176del16、235delC、299delAT，mtDNA基因1494C>T、1555A>G，GJB3基因538C>T，sLc26A4基因IVS7-2A>G、2168A>G 9个突变位点的构成比比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 耳聋基因突变位点在耳聋患儿与正常听力新生儿中的分布情况比较[n(%)]

3 讨 论

耳聋是常见的新生儿出生缺陷，可对患儿智力、语言的发育造成不良影响[5]。因此，早期对新生儿进行听力筛查和诊断，并采取相应的措施具有重要意义。目前，新生儿听力筛查主要采用AABR+OAE，AABR筛查耳蜗以后部位异常导致的听力障碍，OAE筛查耳蜗以前部位异常导致的听力障碍，AABR+OAE筛查可全面覆盖听力传导过程中各部位异常导致的听力障碍[6]，但未通过AABR+OAE筛查的新生儿需要在3个月后才能进行听力诊断性检查，整个诊断过程耗时较长，可能会延误治疗的最佳时机。

相关研究表明，遗传也是导致耳聋的主要因素，有耳聋基因的新生儿其听力在出生后可能没有异常，但可能在以后的成长过程中出现听力障碍，因此检测耳聋基因可弥补听力筛查的不足[7]。对于耳聋基因的检测，目前常用的有微阵列基因芯片法、荧光PCR法等，但微阵列基因芯片法价格较高，荧光PCR法因检测通道限制而不能够同时检测基因的多个突变位点，操作较为复杂。PCR-导流杂交技术只需将探针的膜条与扩增序列一次性杂交，即可对DNA中的多种突变进行同时筛查，其原理是利用扩增的PCR产物和标记的探针杂交后的斑点杂交信号强弱来判断是否突变，具有价格便宜、操作方便等优点[8]。本研究中，AABR+OAE筛查时，共有39例(1.82%)患儿未通过，最终在听力诊断性检查中判定为耳聋；PCR-导流杂交技术共检测出75例耳聋基因携带者，包括9例耳聋患儿和66例正常听力新生儿，耳聋患儿的耳聋基因检出率明显高于正常听力新生儿。上述结果表明，耳聋基因突变在耳聋患儿中的检出率较高，是导致新生儿耳聋的重要原因，与张小娥等[9]的研究结果相同。

GJB2基因是导致遗传性非综合征型耳聋的常见基因，有研究表明，耳聋基因中GJB2基因235delC突变位点的检出率最高。GJB2基因与先天性听力障碍有关，且该基因导致的耳聋患者发病年龄多数为6个月至20岁，多数新生儿在出生后通过了听力筛查，但在成长过程中会慢慢出现听力障碍[10-11]。本研究分析了常见的4个遗传性非综合征型耳聋基因的9个突变位点，结果显示，耳聋基因中，GJB2基因235 delC突变位点构成比最高，占52.00%(39/75)，结果与彭陆衡[12]的研究结果类似。本研究结果还显示，耳聋患儿与正常听力新生儿9个突变位点的构成比比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，表明耳聋患儿与正常听力新生儿不同耳聋基因的突变位点分布无明显差异。

综上所述，采用AABR+OAE对耳聋进行初筛，再联合PCR-导流杂交技术对耳聋基因进行检测可筛查出各种致聋基因，早期指导临床对耳聋患儿进行干预，改善其预后，具有较高的临床应用价值。