基于蛋白组学的中医药辨治大肠癌的研究概述＊

郭玲建，祝利民

（上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032）

蛋白质是生命活动的主要承担者，蛋白质组[1]是依赖于基因组的直接产物，由基因、细胞或组织类型表达的完整蛋白质。蛋白质组学是后基因组时代兴起的新技术，以蛋白质组为研究对象，研究在个体发育的不同阶段，正常或异常情况下，各种细胞内蛋白质的种类、数量、结构和功能状态，从而阐明基因的功能。鉴定并研究这些差异蛋白在生命过程中的作用，对疾病防治、药物开发具有重大意义。

大肠癌包括结肠癌和直肠癌，是全球常见的恶性消化道肿瘤之一，根据美国癌症协会最新的全球癌症数据统计[2]显示，大肠癌在全球癌症死亡率和发生率中皆居第三位。在我国国家癌症中心[3]收集的数据表明大肠癌死亡率位居前五，发病率紧随肺癌、胃癌之后，且发病率呈逐年上升趋势。大肠癌患者的治疗以手术和化疗为主，放疗、免疫治疗、靶向治疗和中医药治疗多种治疗手段相结合，其中中医药疗法贯穿患者治疗的全过程，在增效减毒[4]、预防转移、降低复发率及提高患者生存质量、延长生存期等方面具有良好效果。蛋白组学作为系统生物学的一部分，从微观研究到宏观表征，整体的、系统的解析生命过程的研究特点与中医药的“整体观”、“辨证法”、“动态性”的理念不谋而合，使得传统中医药研究能够以蛋白水平的强大生命科学技术为依托，输出中医药治疗大肠癌的“微观”机理并深入找寻其作用机制反馈于临床[5-6]。蛋白组学技术运用于中医证候、中药作用机制的研究成为趋势，故本文从中医学的核心思想“辨证”（中医证候）、“论治”（中药作用机制）两个角度对蛋白组学的大肠癌中医药研究进行归纳总结，以期为大肠癌的现代化研究提供参考。

1 中医证候

证候是指机体正邪斗争的动态过程中的某一阶段的病理体征和主观症状的概括，具有系统性、空间性、时相性[7]的特点。蛋白组学是以细胞或组织不同时间和环境的蛋白质总体为研究对象，在蛋白水平整体地揭示疾病发展过程中蛋白表达的动态变化，这与中医辨证的核心理念“整体观”、证候演变的“动态性”极为相似。因此应用蛋白组学技术研究大肠癌证候，有利于阐明其本质，揭示机体病理改变的物质基础。

1.1 异病同证

从不同疾病的同一证型探索大肠癌是辨证分型客观化的角度之一。季青等[8]为探索大肠癌和肝癌“异病同证”的物质基础，分别采集肝肾阴虚证和无证可辨的大肠癌、肝癌患者的血浆并提取蛋白，利用同位素相对标记、iTRAQ 标记和液相色谱串联质谱联用技术鉴定，结果显示大肠癌术后与肝癌术后肝肾阴虚证组共同的差异蛋白有8个。这些蛋白主要与补体和凝血级联途径有紧密联系，KNG1、HBA2 等蛋白可能是大肠癌和肝癌“异病同证”的物质基础之一。本课题组[9]前期还做了大肠癌与肝癌术后肝肾阴虚证的代谢组学研究，结果显示二者的共同代谢物是甘氨酸、尿素、色氨酸和丙氨酸，其代谢调控以氨基酸降解为主。

1.2 同病异证

纵向研究同一疾病的不同证候是中医认识大肠癌的另一角度。徐玉芬等[10]利用双向凝胶电泳和质谱分析对辅助治疗期大肠癌脾气虚证、胃阴虚证、平和证型患者的血清蛋白质组进行分析，筛选出13个表达有显著差异的蛋白质，其中血红素前体、α-1-B-糖蛋白、色氨酸羟化酶-1、结合珠蛋白在胃阴虚证、脾气虚证患者血清中表达均上调，α-2-糖蛋白1 表达下调，胰蛋白酶抑制剂HI30、转甲状腺素蛋白在胃阴虚证患者中表达上调，在脾气虚证患者中表达无显著差异。结果表明大肠癌辅助治疗期脾气虚证、胃阴虚证形成存在不同的分子基础，可作为辨证论治的潜在客观指标。孙校男等[11]收集了辅助治疗期结肠癌湿热证、脾虚证及无症状患者的血清各8 例，进行双向凝胶电泳及质谱鉴定。结果显示湿热证组较无症状组维生素D结合蛋白升高，血清结合素前体、β-解离抑制因子（β-GDP）、载脂蛋白A-I前体和簇蛋白均降低。脾虚证组较无症状组β-GDP、簇蛋白及血清结合素前体升高，前白蛋白原、载脂蛋白A-I 前体及维生素D 结合蛋白均降低，表明这6 种差异表达蛋白的组合性变化可能是辅助治疗期结肠癌的物质基础。程德金[12]应用iTRAQ 标记定量蛋白质组学技术对健康人及大肠癌脾虚证和湿热证患者间的唾液蛋白进行定量，结果显示大肠癌脾虚证患者与健康人间的差异蛋白有378个；大肠癌湿热证患者与健康人间的差异蛋白有493个；大肠癌湿热证与脾虚证间的差异蛋白分别有299个、414个，共有的差异蛋白为79个。

1.3 同病单证

对同一疾病单一证候的研究是辨识大肠癌证候分子机制的有效手段。孙校男等[13]收集大肠癌辅助化疗期血瘀证、脾虚证及平和质患者血清各8例，进行双向凝胶电泳及质谱鉴定。结果显示在血瘀证及脾虚证大肠癌患者中转移相关蛋白、触珠蛋白、微管蛋白α链3、β-二磷酸鸟苷（β-GDP）、血清载脂蛋白A-I均高表达，凝血酶原、二氢叶酸还原酶样蛋白质、血管生长因子受体-1、肿瘤蛋白DJ-1 在血瘀证中高表达但在脾虚证中低表达，神经生长因子G-1、白细胞介素-27α 在血瘀证患者中低表达而在脾虚患者中高表达，表明这11 种差异表达蛋白的组合性变化可能是大肠癌血瘀证的物质基础。周小军等[14]为从蛋白质水平探讨大肠癌湿热蕴结证的本质，采用双向凝胶电泳法分离30 例大肠癌湿热蕴结证患者肿瘤组织和20 名正常人结肠黏膜组织的蛋白质，鉴定出20个差异蛋白。大肠癌湿热蕴结证与对照组比较，有15个蛋白上调，5个蛋白下调，表明大肠癌湿热蕴结证患者和健康人的蛋白质表达具有差异，为在蛋白质水平研究湿热蕴结证本质提供了物质基础。白玉茹[15]为探寻脾虚湿盛型大肠癌的客观依据，选取23例经病理确诊的脾虚湿盛型大肠癌患者的组织进行iTRAQ 定量蛋白鉴定并进行生信分析和WB 验证。结果显示MGST2、RRM2、SRM、GSTT1、GPX3、GSTM3 这六个差异蛋白经WB 验证与iTRAQ 结果一致，为脾虚湿盛型大肠癌的发生发展机制及相关肿瘤标志物的研究提供了新的线索。

在大肠癌中医证候的蛋白组学研究中，研究者多以人体血清、组织为样本进行蛋白质组检测和生信分析，探索以证候为中心的“异病同证”、“同病异证”、“同病单证”的物质基础，为大肠癌证候辨识的标准化、客观化提供量化依据，对指导临床诊疗和预后具有重要意义。

2 中药作用机制

蛋白组学作为后基因组时代兴起的新技术，将其引入中药研究，以蛋白表达差异的直观方式阐述中药作用于机体的机制，摆脱“经验医学”的桎梏，推动中药治疗疾病的现代化研究。蛋白组学是高通量的信息集合，结合蛋白组学研究大肠癌的中药治疗，有利于寻找中药作用于大肠癌的位点，更深入的认识其作用机制，应用于临床实践。

2.1 中药复方

陈纯辉[16]为观察大黄䗪虫丸是否通过改善肝脏的纤维化状态来抑制大肠癌的肝转移，采用无标记比较蛋白组学对MC38-EGFP 细胞在C57BL/6J小鼠体内衍生的外切体进行分析。结果显示大黄䗪虫丸能够显著降低肝脏趋化因子2（CCL2）及其受体CCR2 的表达，减少荷瘤小鼠肝脏巨噬细胞浸润，减轻M2 极化，减少F4/80 阳性面。说明大黄䗪虫丸通过抑制CCL2介导的M2 偏斜范式，改善促纤维化微环境，抑制大肠癌肝转移。

2.2 中药有效成分

已有报道姜黄素是包括大肠癌在内的多种癌症类型中的有效化学预防和治疗剂，Sato 等[17]为进一步了解其如何发挥抗癌活性，使用SW480和SW620人结肠癌细胞进行蛋白组学分析。结果鉴定出39 种姜黄素调节的磷蛋白，其中5种参与癌症信号传导途径，进一步分析表明mTORC1和p53信号通路是姜黄素的主要靶标。Tai 等[18]使用绞股蓝皂苷（GpS）治疗Apc(Min/+)大肠癌模型小鼠，证实GpS 可显著减少小鼠中的肠息肉数量和大小，并进行蛋白组学分析，鉴定了GpS 处理后的40 种差异表达蛋白，这些蛋白大多与细胞氧化还原稳态有关，经WB 验证了与其有关的Peroxiredoxin-1、Peroxiredoxin-2 的上调及 Raf-1 的下调，还发现GpS 可增强5-氟尿嘧啶（5-FU）的抗癌功效。强调了GpS 作为抗癌药的潜力及其抗癌的潜在机制，和在结直肠癌化疗中作为5-FU 佐剂的作用。雷公藤甲素是一种二萜类三环氧化物，提取自中草药雷公藤。Liu 等[19]使用蛋白质组学技术研究雷公藤甲素处理的结肠癌细胞，结果显示雷公藤甲素引起了与细胞周期和凋亡相关蛋白14-3-3 epsilon 的裂解和核周移位，表明雷公藤甲素可能值得作为结肠癌的潜在治疗剂进行研究，其抗癌作用可能与14-3-3ε 的改变有关。薯蓣皂苷提取于穿龙薯蓣，是抗结肠癌的有效药物。Chen 等[20]采用iTRAQ 技术研究薯蓣皂苷处理与未处理结肠癌细胞HCT116，鉴定出288个差异表达蛋白。结果表明薯蓣皂苷诱导结肠癌细胞毒性的分子机制与氧化磷酸化、Wnt、p53和钙信号通路有关。

2.3 有效成分衍生物

Kim 等[21]为检测人参皂苷的衍生物-新型人参皂苷(G-Rp1)的抗增殖和促凋亡活性的分子靶标，进行了二维凝胶电泳蛋白质组学分析，结果显示G-Rp1 明显上调了结肠癌Lovo 细胞中的SNU-407、DLD-1、SNU-638、AGS、KPL-4、SK-BR-3和Apo-A1的蛋白水平，通过敲除Apo-A1 的小干扰RNA 上调了ADP-核糖和p53 的水平，并抑制了Lovo 细胞的增殖，表明GRp1 可能通过上调Apo-A1 抑制细胞增殖，促进凋亡，从而发挥抗癌作用。双青蒿素是青蒿素衍生物，Lu等[22]在前期研究中建立了结肠癌细胞HCT116 的双青蒿素耐药株HCT116/R，并对HCT116/R 的抗增殖和耐药特性进行了蛋白组学研究，鉴定出8 个差异表达蛋白，结果表明双青蒿素可能不会诱导结肠癌的多药耐药表型，且为进一步研究其抗癌机制提供了新的线索。

中药复方抗大肠癌的蛋白组学研究较少，中药有效成分治疗大肠癌的蛋白组学研究是当前热点，其中青蒿素[23]及其衍生物[22,24]、姜黄素[17,25-28]、雷公藤甲素[19,29-30]的研究较多，同时常见食物提取物[31-36]对大肠癌的“食疗”作用也得到了更多关注。

3 小结与展望

蛋白组学的发展为中医药认识和治疗大肠癌提供了新思路，拓展了新方法，在一定程度上挖掘了中医药与大肠癌的科学内涵，促进了中医药与现代医学的汇通，但仍存在不足之处。大肠癌证候的蛋白组学研究多围绕差异表达蛋白独立的生物学意义描述，若同时关注差异表达蛋白间的互作关系和多组学联用探索大肠癌证候的分子机制，不仅将更加贴合中医学“整体观”的理念，也将提高证候分型量化标准的可靠性、逻辑性。中药复方虽在传统中医药的应用中占主导地位，然由于其化学成分复杂、作用靶点多、研究难度大，基于蛋白组学的中药复方抗大肠癌研究较少，因此可以从有效成分或其衍生物入手，对复方中的主要有效成分进行蛋白组学分析，然后通过生物信息分析等手段整合，以“化整为零-归零为整”方式运用蛋白组学进行中药复方抗大肠癌的机制研究，做到“病与药”的结合。

蛋白组学技术在传统中医药研究中的应用[37]是现有研究手段中的热点，因此本文系统回顾了蛋白组学在中医药抗大肠癌中的主要研究领域。蛋白组技术远比基因组技术复杂和困难，蛋白质不仅有着复杂的翻译后修饰，且蛋白组学研究需要制备大量的蛋白质，因此在蛋白质的分离、扩增和纯化上还存在一定的难度，仍需完善拥有高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台。但随着蛋白芯片、双向电泳、蛋白质谱等技术的不断成熟与使用，蛋白组学技术将在阐明中医药防治大肠癌机制上发挥重要作用，尤其是为本课题组下一阶段研究中药作用于大肠癌的机制提供了重要的技术支持。