幽门螺杆菌外膜蛋白及其毒力的研究进展

徐晨静, 吴 瑶, 蒋建霞, 张国新, 徐顺福

(1. 南京医科大学附属逸夫医院 消化内科, 江苏 南京, 211100;2. 南京医科大学附属第一医院 消化内科, 江苏 南京, 210000)

幽门螺杆菌(H.pylori)是人类最常见的胃上皮致病菌之一。据研究[1-2]报道，全球H.pylori总患病率为44.3%, 发展中国家为50.8%, 发达国家为34.7%, 全球年复发率为4.3%。H.pylori与消化性溃疡、胃癌、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤相关，感染后的临床结局往往取决于宿主、细菌和环境因素的相互作用[3-4]。H.pylori为革兰氏阴性菌，其外膜位于脂质双分子层外包围着整个细菌，是细胞壁的独特组成部分[5]。外膜蛋白(OMPs)在细菌定植、持续感染和严重的临床结局中起重要作用[6]。H.pylori的OMPs主要包括脂蛋白、孔蛋白、铁调节蛋白、泵蛋白等。OMPs的致病性可能是通过以下机制实现的: ① 黏附作用; ② 对防御屏障的渗透作用; ③ 免疫逃避机制。

约4%的H.pylori基因组编码了大量的OMPs, 这些OMPs可被分为5个同源基因家族。最大的家族1包括外膜孔蛋白(Hop)和外膜孔蛋白相关蛋白。家族2和3分别包括外膜蛋白Hof和外膜蛋白Hom。家族4和5分别包括铁调节蛋白和泵蛋白，还有一些均不属于这些家族的OMPs[7]。现就6个重要的OMPs即血型抗原结合黏附素(BabA/HopS)、唾液酸结合黏附素(SabA/HopP)、前炎性蛋白A(OipA/HopH)、外膜孔蛋白Q(HopQ)、外膜孔蛋白Z(HopZ)、外膜蛋白Hom的最新进展进行综述，包括其同源基因及其基因位点，相应的受体，与其他毒力因子的共表达情况及其与临床疾病的关系，OMPs相关性疫苗的研发使用。

1 主要OMPs

1.1 BabA/HopS结合组织血型抗原发挥黏附作用

BabA是Hop蛋白家族成员之一，又称HopS, 即血型抗原结合黏附素。Bab基因的3个等位基因babA、babB和babC可以在至少3个不同的基因组位点中找到[8-9]。系统发育分析表明,babA和babB的等位基因组相互独立，存在地理变异。对这些基因组位点的同义和非同义替换的研究表明,babA更具有多态性，这意味着其起源比babB更早。同时,babA多态性区域可能有更多的功能限制，表现为美国和亚洲菌株babA有明显的区别。

BabA已被证明具有黏附素的功能。Ilver D等[10]对H.pylori的BabA进行纯化后发现BabA选择性地黏附于胃上皮细胞岩藻糖基的路易斯b(Leb)组织血型抗原上。菌株17875有2个babA等位基因[11]，分别是babA1(沉默)和babA2(表达),babA2-cam是babA2的衍生基因，是研究者通过将原来沉默的babA1基因重组到表达且部分同源babB基因位点而获得的，具有与Leb结合的能力。有趣的是，嵌合的BabB/A黏附素与Leb结合的亲和力与野生型BabA黏附素相似，但BabB/A表达水平较低，并且可通过滑链错配机制发生相变异。这些结果均表明，黏附素的可转移性和异质性有助于增强细菌的适应力，一些菌株根据宿主对感染的反应，具有周期性激活和灭活自身毒力的潜力。BabA介导的黏附功能对酸性环境敏感, BabA表达的缺失不依赖于Leb的表达情况，也不依赖于BabA与Leb的结合能力[12]。同时, BabA表达的缺失并不是由适应性免疫或toll样受体信号导致，除了作为与Leb结合的黏附素外, BabA可能还有其他未被识别的功能[13]。最近的X射线结构研究[14]揭示了BabA的3个Leb结合位点，包括2个多样性环(DL1和DL2)和1个保守环(CL2)。这个结构表明结合过程是由Leb岩藻糖基1、N-乙酰葡糖胺3、岩藻糖基4和半乳糖残基之间的氢键网络和BabA的8个氨基酸残基介导的[15]。以往临床根据H.pylori结合血型的不同，将其分为“特异菌株”和“非特异菌株”。特异菌株只与O血型Leb抗原结合，非特异性菌株可与A、B和O血型Leb抗原结合，因此认为消化性溃疡患者更可能是O型血而不是A或B型血，最新的BabA X射线结构研究[14]推翻了这一观点，即BabA与各种血型的Leb抗原结合力是相同的。

相比于H.pylori感染的无症状患者，表达BabA的菌株在消化性溃疡或胃癌患者中更为常见。目前已证实BabA与临床疾病的发生发展是呈正相关的[16]。Ⅳ型分泌系统是由cag致病岛编码的[17]，Ⅳ型分泌系统可将同样由cag致病岛编码的细胞毒素相关蛋白(CagA)毒力因子递送至所吸附细胞，随后, CagA诱导几种促炎细胞因子的转录。H.pylori可以利用BabA-Leb结合来触发Ⅳ型分泌系统依赖的宿主细胞信号传导，然后诱导增强炎症、肠上皮化生和相关癌前转化基因的转录[18]。

1.2 SabA/HopP结合Lewis抗原发挥黏附作用

SabA也称为HopP或OMP17, 是H.pylori第2个被详细研究并报道的黏附素。Sab有2个等位基因，分别为sabA和sabB(omp16,hopO)[7, 19]。SabA与sabB这2个等位基因和hopQ(omp27)具有高度的核苷酸同源性(80%～100%)。尽管所有的临床菌株都至少有1个sabA基因拷贝，但体外实验[20]表明, 由于sabA和sabB有相似的基因转化率，在宿主作用下往往选择性表达sabA基因。在5′端的二核苷酸重复区，通过滑链错配机制的相变异，从而调节SabA和SabB的表达。虽然sabA的相变异可以在整体水平上控制基因表达，但是H.pylori也可以在单细胞水平上通过少量的二元信号转导系统调节基因表达，该系统可以在转录水平上适应环境变化。由于环境pH值的变化也是刺激因素，所以二元信号转导系统也被称为酸应答信号[21]。

Pang SS等[22]对SabA进行X射线晶体学研究后发现, SabA的可溶性胞外黏附素域与四磷酸腺苷重复折叠家族有很大的相似性，黏附素域的N-末端和C-末端螺旋从头部区域以直角伸出，一起形成1个轴，连接到预测的OMPs样管状跨膜区域。同时利用表面等离子体共振，其能够检测到SabA黏附素域与胃上皮细胞的唾液酸-LewisX和LewisX的结合，但不能检测到与LewisA、LewisB或LewisY的结合。SabA的黏附机制是通过调节宿主的唾液酸-LewisX的表达，在特定的糖基转移酶β-1, 3-半乳糖转移酶5的诱导下，参与Lewis抗原的生物合成，从而加强上皮黏附功能并成功定植在胃黏膜上皮细胞表面[23-24]。

与BabA等其他黏附素一样，SabA表达频繁的“开/关”状态提示SabA表达可以快速响应胃生态环境的变化，比如SabA的表达情况可以随着炎症加重等情况而迅速改变。SabA表达情况与胃分泌酸的能力呈负相关，提示其表达可能受胃酸分泌变化的调节。H.pylori菌株对唾液酸糖结合物的黏附能力可能是导致H.pylori感染慢性化的原因之一[25]。除此之外，流行病学研究[26]表明胃癌与SabA表达密切相关。然而, SabA状态对亚洲H.pylori感染的临床结果影响不大[27-28]。

1.3 OipA/HopH诱导炎症反应

OipA是由oipA基因(hopH)编码的，其在幽门螺杆菌基因上的位置距离cag致病岛约100 kb。OipA通过V型分泌系统插入并定位于H.pylori的外膜。有趣的是,oipA的“开”状态和cagA是紧密联系在一起的，在cagA阳性菌株中,oipA通常是“开”状态，表现为全长OipA蛋白的表达[29]。OipA的主要致病机制是使胃上皮细胞分泌白细胞介素-8(IL-8)增多，加重胃部炎症。Al-Maleki AR等[30]还证明OipA在体外可以抑制胃细胞的凋亡。OipA在局灶性黏附激酶的激活中发挥重要作用，局灶性黏附激酶是一种胞质非受体酪氨酸激酶，作为支架蛋白来募集含有SH2和SH3结构域的分子，调节细胞的形状、迁移和活性[31-32]。OipA的“关”状态使β-连环蛋白核易位且降低癌的发病率[33]。但是OipA的具体致病机制仍存在一定的争议，Yamaoka Y等[34]发现OipA在体外并没有改变胃上皮细胞IL-8的分泌量。但可以肯定的是，只有oipA“开”状态与高H.pylori密度、严重中性粒细胞浸润和黏膜IL-8水平增高显著相关。目前, OipA的相关受体尚未清楚。

OipA是一种与许多临床症状如消化性溃疡、胃癌和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤有关的毒力因子，无论是东方菌株还是西方菌株都没有显著差异[33, 35]。接种OipA疫苗的C57BL/6小鼠细菌定植数量显著减少,H.pylori相关的炎症也减轻，表明这种重要的免疫原性蛋白可能是保护宿主免受H.pylori感染的候选疫苗[36]。

1.4 HopQ的黏附作用介导Ⅳ型分泌系统转运

HopQ基因编码HopQ，属于H.pyloriOMPs基因的Hop家族。HopQ基因有2种等位基因，即Ⅰ型和Ⅱ型。有研究[37]报道, 72.5%的菌株中存在hopQⅠ型, 15.4%的菌株中存在hopQⅡ型，而12.1%的菌株是Ⅰ型和Ⅱ型混合型或未通过PCR检测到hopQ表达。亚洲菌株和西方菌株的比较研究[37-38]表明，亚洲国家的hopQⅡ型菌株极为罕见。

BabA介导的黏附作用增强Ⅳ型分泌系统的活性，而HopQ是CagA通过Ⅳ型分泌系统转运的关键。HopQ蛋白具有利用癌胚抗原相关细胞黏附分子家族(CEACAMs)作为宿主细胞受体的能力[39]。CEACAMs具有广泛的组织特异性分布，如CEACAM1在白细胞、内皮细胞和上皮细胞中表达，CEACAM3在粒细胞中表达，CEACAM5在上皮细胞中表达，CEACAM6在上皮细胞和粒细胞中表达[40]。HopQ与CEACAM的结合具有高度的亲和力[41]，HopQⅠ和HopQⅡ都可以与CEACAM1的N-末端结构域的β链相结合。在表达CEACAM5的人源化小鼠中，CEACAM受体在H.pylori感染中发挥作用，并可能在体内产生长期影响[42]。在西方和亚洲菌株中,hopQⅠ型基因型与细胞空泡毒素(VacA)s1和m1基因型以及cagA阳性显著相关。因此,hopQ可能成为一种提示胃十二指肠疾病的毒力因子[38]。

1.5 HopZ具有黏附作用

人们对Hop家族中的hopZ基因也进行了广泛的研究。同hopQ一样,hopZ有2个等位基因,hopZⅠ型和hopZⅡ型。2个等位基因之间最显著的差异是hopZⅠ型存在1个hopZⅡ型没有的基因片段编码的20个氨基酸区域，其中hopZⅡ型的氨基酸序列保守性要高于hopZⅠ型[43]。

迄今为止, HopZ的宿主受体尚不明确，尽管如此，有研究[44]推测HopZ可能在黏附中起着重要的作用。通过对15个不同菌株的hopZ基因进行序列分析发现，位于信号肽编码区的1个CT二核苷酸重复序列模体可能通过滑动错配机制调控hopZ的表达[45]。Kennemann L等[46]对1位感染H.pylori的志愿者胃部提取的菌株研究后未发现重组的证据，只发现了很少的差异，这些差异是由于相变异导致hopZ基因开关造成的，表明在H.pylori早期定植过程中，具有黏附作用的HopZ在体内有很强的选择性。此外,hopZ在同一胃内的相位可以非常稳定，这证明hopZ基因在没有多个菌株混合感染的情况下是稳定表达的。目前没有足够的证据可以证明HopZ与其他致病因子如CagA或VacA有关系[47]。一项研究[46]对63例慢性萎缩性胃炎患者的临床分离株进行分析后发现,hopZ表达与否与慢性萎缩性胃炎无显著相关性,hopZ与临床疾病的关系尚不明确。

1.6 Hom与其他毒力因子共表达影响疾病的发生发展

Hom家族包括4个基因，即homA、homB、homC和homD。HomA和homB在核苷酸水平上有90%的相似性，具有2个保守位点[7]。另一方面,homC、homD与homA、homB有一定的差异性，表现为保守位点的不同。HomA、homB和homC的表达情况因菌株的地理来源而异，而homD高度保守。Oleastro M等[48]在核苷酸和氨基酸水平上对homA和homB进行了详细的序列分析，发现了6个不同的、保存良好的AⅠ到AⅥ等位基因，其中homA基因有3个等位基因变异(AⅡ、AⅢ和AⅣ), 而homB基因有5个不同的等位基因变异(AⅠ、AⅡ、AⅢ、AⅤ和AⅥ)。AⅠ、AⅤ、AⅥ只在homB中出现，而AⅣ只在homA中出现。HomA和homB基因在世界范围内的菌株中分布不均，东亚和西方的菌株存在明显差异[48]。Kim A等[9]发现，不同地理起源的homC变异与bab存在一定的关系，其鉴定了3种homC多态形式homCS、homCM和homCL, 并发现homCL与bab相关性最高，而且这种相关性与所检测的人群无关。目前关于Hom相关受体尚不明确。

HomB的作用主要是增加H.pylori对宿主细胞的黏附，促进促炎细胞因子IL-8的分泌。有研究[49]发现homB与儿童和年轻人消化性溃疡的发展有显著相关性，而homA与非溃疡性胃炎相关[50]。此外,homB可以作为区分胃癌与十二指肠溃疡的毒力因子[51]。然而，另一些研究者并没有发现homB与胃癌进展之间的联系，这表明Hom对疾病的影响可能与其他毒力因子的存在有关[52]。

2 OMPs作为治疗靶点

细菌的耐药机制主要包括3个方面: 产生相应的水解酶和修饰酶以破坏药物活性; 改变药物靶标的结构，使药物无法被识别; 阻断药物与靶部位的接触，包括调节细胞膜通透性和抗生素排出系统的作用。随着越来越多的H.pylori耐药菌株的出现，人们正致力于寻找除抗生素以外的其他治疗H.pylori的方法，目前,H.pylori疫苗的研究与开发是一个热点方向。以往研究[53]表明,H.pylori尿素酶具有免疫原性，一项三期随机双盲对照试验[54]将尿素酶B亚基与热不稳定肠毒素B亚基混合作为口服疫苗，应用于6～15岁接种儿童具有良好的H.pylori感染保护作用，尽管后来疫苗保护效力略有减弱，但总体保护效应持续约3年之久。

OMPs与革兰氏阴性菌调节细胞膜通透性和抗生素排出系统从而实现耐药性密切相关。对于无症状的H.pylori感染患者，分析从其胃内分离出的菌株来确定OMPs的表达是至关重要的。这将实现个体化治疗，降低耐药率。对大肠杆菌、钩端螺旋体和铜绿假单胞菌的蛋白质组学研究[55]已经证明, OMPs与细菌的耐药性有关，也有许多研究使用蛋白质组学来筛选合适的OMPs作为疫苗的候选因子。BabA可以被认为是一种候选疫苗, Mirzaei N等[56]证实了重组BabA可以刺激H.pylori感染的体液和细胞免疫。OipA在H.pylori黏附后定植的第1步中也起着至关重要的作用，可以作为疫苗开发的候选抗原[36]。其他的OMPs如HopB、HopC和HopZ等正在进一步研究中。

3 小 结

OMPs在H.pylori的定植过程中起着重要的作用。H.pylori黏附于充满黏液的胃上皮细胞是一个复杂的过程，其中涉及多个黏附素和不同受体，这些受体根据炎症状态和聚糖表达情况产生一定的变化。OMPs不仅介导细菌黏附于胃上皮细胞，还配合其他毒力因子如CagA和VacA增加炎症因子的释放。因此，OMPs在一定程度上决定了H.pylori菌株的毒力。了解OMPs与受体相互作用及其致病机制，对预防和治疗H.pylori感染至关重要。此外，临床应进一步挖掘OMPs抗原作为疫苗的潜力，期望在这方面的进一步研究有助于对抗H.pylori的耐药性，并改善H.pylori感染的临床结局。