分子生物学技术在饲料微生物检测中的优势

胡靖宜，王忠艳

（东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨 150040）

1 微生物检测意义

近年来，饲料安全问题频发，引起广泛关注，饲料安全问题一般由致病菌引起。随着社会的高速发展，分子生物学技术成果显示强大优势。人工模拟酶、催化剂，领导化学工业新革命。此外，分子生物学技术可应用到化学方面及饲料的微生物检测，能够保证饲料安全和人类健康。

通常情况下，在饲料的生产、加工、运输过程中极易被微生物感染。通常在饲料中加入防腐剂、防霉剂，但保鲜效果不明显。饲料一旦受到微生物污染营养价值就会降低，动物在食用霉变饲料后，易生病或死亡，造成经济损失。

饲料安全问题备受关注，饲料检测技术也日渐完善，饲料中不允许存在危害动物健康的细菌、真菌等。为了快速高效地检测饲料中微生物的含量各国家的重大战略问题[1]。

2 微生物检测传统方法

研究显示，传统方法培养微生物种类较少，约为环境中微生物含量1%，无法准确检测饲料中微生物种类和数量。

目前，国内对饲料微生物检测传统方法有平板涂布法、血球记数板直接记数法、酶联免疫吸附测定法等[2]。传统微生物检测方法在饲料的微生物检测中存在以下几点不足：

（1）准确性低：检测饲料中微生物数量准确性不高，且种类有限；

（2）检测时间长：由于样品需要培养，通常需要数小时甚至几天的检测时间；

（3）易污染：传统检测方法需要样品培养，流程相对复杂，对样品的处理过程中易造成污染。

随着科学技术不断发展，分子生物学技术在微生物检测领域显示优势，具有特异性强、速度快、无需样品培养、污染小、精度高、检测范围广以及试剂耗材相对较少且成本低的优点[3]。

3 饲料中微生物检测

我国饲料微生物检测细菌主要是大肠杆菌、霉菌及沙门氏菌。

大肠杆菌是粪便污染的指示菌，显示饲料是否存在粪便污染。动物一旦食用被大肠杆菌污染饲料后，损伤肠道上皮细胞，且产生某种肠毒素。

霉菌是主要危害饲料微生物群，我国因饲料霉变而导致的经济损失巨大。饲料被霉菌污染后会降低其营养价值，动物食用后免疫系统受到干扰，影响动物正常生长发育。沙门氏菌能够感染多种动物宿主，具有侵袭性，大部分动物感染沙门氏菌后，容易引起动物伤寒、副伤寒及急性胃炎发生，排出黏性血便和水样便。

相比传统方法，分子生物学技术作为一种新型的检测技术，以分子水平研究生物大分子的结构与功能，以基因序列多样性为检测原理，通过识别并标记饲料中相应分子，达到检测饲料中微生物种类和含量目的。在饲料的微生物检测中，主要采用PCR技术、基因探针技术和基因芯片技术。因饲料检验工作范围大，分子生物学技术可高效、精准检测饲料中微生物的种类和含量，所以，可将该技术应用于饲料的微生物检测。

4 分子生物学技术主要检测手段

4.1 PCR技术

PCR技术具有较强特异性和灵敏度、检测速度快、准确性高。广泛应用在食品微生物检测各领域，逐步用于饲料微生物检测。PCR技术是以一段DNA 作为模板，在DNA 聚合酶和核苷酸底物共同参与下，大量扩增该段DNA，检测其扩增产物后进行分析。在饲料微生物检测中，通过聚合酶反应，能够检测饲料微生物病原，得到饲料中致病菌含量。PCR技术特异性强，灵敏度高，能够快速得出检验结果。

沙门氏菌是一种人畜常见的食源性致病菌，对动物危害很大。饲料卫生标准中规定，饲料中不可以存在沙门氏菌。目前，沙门氏菌检测方法是前增菌、增菌、分离等步骤。操作复杂且耗时较长，无法满足发展需要。GB/T 28642-2012《饲料中沙门氏菌的快速检测方法聚合酶链式反应（PCR）法》于2012年第17 号发布，该标准规定饲料中沙门氏菌快速检测的方法聚合酶链式反应（PCR）法，并于2012年11月起正式实施。这表明PCR技术将广泛应用于沙门氏菌检测。

随着研究不断深入，将在饲料沙门氏菌及其他致病菌的检测中得到更多的应用[4-10]。

4.2 基因探针技术

该方法又被称为核酸分子杂交法，为DNA 分析奠定良好基础, 并得到相关领域认可。基因探针技术利用互补基因的特异性，能够识别特异碱基序列中一段单链DNA 或者RNA 分子，然后再与靶细胞杂交，对杂交产物进行检测，即可得到微生物含量。能够快速灵敏地检测到致病性微生物。工作人员对病原体进行分离或标记，制作探针，任何病原体都有核酸片段，利用有标记探针可进行杂交工作，如样品中有特定病原体，要明确病原体中特定性，结合探针与核酸序列[5]，通过特殊方法测定标记物。

基因探针技术不但可以检测特异RNA，还可以检测任意一种微生物。由于其特异性强、灵敏度高等优势获得了学术领域的认可，但基因探针技术仍然存在一定的不足，成本较高，操作也比较繁琐，还会对人体产生一定的危害，限制基因探针技术的发展。所以，需要进一步优化非放射性标记探针，将探针信号放大，研究简单的杂交形式，使该方法更加简单、便捷[6]。

4.3 基因芯片技术

目前，微生物检测较为常见的技术就是基因芯片技术，基因芯片技术主要应用原理是杂交测序，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。用荧光素进行标记，通过分析荧光分布确定检测样品中的特定微生物，有助于分析总结有害微生物的特征[11]。基因芯片能够同时分析数万个基因，进行高通量筛选与检测分析，解决传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少等不足。

在对饲料中微生物检测的过程中，主要通过对微生物检验中的基因序列识别，发现基因识别中存在问题并进行标记，通过序列变化识别饲料中微生物种类及含量。也可以通过基因序列变化判断是否存在微生物超标，检测控制饲料中微生物含量，保障饲料的安全[12]。

5 结 语

由此可见，分子生物学技术在饲料微生物的检测中具有明显的优势，通过分子生物学高效、快速等优点，可有效提高饲料中微生物检测效率进而改善饲料质量，提高饲料的安全性。

对饲料中微生物检测的同时，还应将分子生物学技术应用细化，用不同技术检测不同微生物种类，完善分子生物学技术的应用。