基于网络药理学的金银花-贯众治疗COVID-19机制研究

王钰婷，刘青松，张海洋，胡文杰，郭静，彭文禹

（成都中医药大学附属医院，四川 成都）

0 引言

2019年12 月下旬，我国湖北省武汉市报道了一系列不明原因肺炎（后被命名为COVID-19），患者主要表现为干咳，呼吸困难，发热和影像学上双侧肺浸润。COVID-19 属于中医“疫病”范畴，大多数患者的临床证候表现为湿热郁肺，或湿毒蕴肺，或寒湿郁肺，入里化热，可表现为疫毒闭肺等证，重症患者表现为内闭外脱[1]。据其病程证候分析，清热解毒类中药的使用在COVID-19 治疗过程中具有重要作用。

金银花、贯众是临床常用清热解毒药对。已有研究表明，金银花、贯众有很好的抗病毒疗效[2]。一项基于网络药理学统计新型冠状病毒肺炎63 个预防方剂和中成药的研究发现，金银花、贯众为治疗COVID-19 使用的高频药物[3]。金银花既能清热解毒、又具轻宣疏散之性，能清解温热疫毒之邪。现代药理学研究表明金银花有良好的抗病毒、抑菌抗炎、解热等作用[4]。贯众具有清热解毒、凉血止血的功效，自古以来即在预防瘟疫药物中有较高的地位。现代药理研究表明绵马贯众对流感病毒(FM1 株)、呼吸道合胞病毒(Long)、副流感病毒(Ⅰ型、Ⅲ型)、腺病毒(AD3)均具有一定的抗病毒作用[5]。

金银花-贯众在COVID-19 的预防及治疗中占有一定地位，但其作用机制不明确仍需进一步探讨。网络药理学融合多学科的技术和内容，揭示中药及其复方治疗疾病多成分、多靶点、协同作用的网络关系，其整体性、系统性、动态性的特点，与中医药整体观、辨证论治、 组方配伍的原则不谋而合，在推动中医药现代化和国际化中发挥着重要作用[6]。本研究将基于网络药理学，探讨金银花-贯众药对治疗CIOVID-19的可能作用机制，以期为金银花-贯众药对治疗CIOVID-19提供进一步深入研究的资料。

1 材料与方法

1.1 金银花-贯众有效活性成分筛选及潜在靶点预测

以“金银花”，“贯众”为关键词，通过TCMSP（https://www.tcmspw.com/tcmspsearch.php/）检索，以药物口服生物利用度（OB ≥30%）及类药性指数（DL ≥0.18）作为筛选标准，获得药物成分及其靶点蛋白。上传Uniprot 数据库 （http://www.uniprot.org/）对上述靶点蛋白进行矫正及去重。

1.2 疾病靶点获取

通 过GeneCards 数 据 库（https://www.genecards.org/），OMIM 数据库（https://omim.org/），以“novel coronavirus”作为关键词进行检索，获得COVID-19 相关基因。将上述基因靶点与金银花-贯众药对潜在靶点筛选出共同基因，利用R 软件3.6.2 制作韦恩图。

1.3 金银花-贯众治疗COVID-19 成分-靶点网络图构建

将上述得到的药物活性成分, 共同基因导入Cytoscape3.7.2 软件，构建金银花-贯众药对治疗COVID-19的“药物-成分-靶点”网络图。

1.4 构建蛋白互作网络及核心靶点分析

将1.2 得到的共同基因上传String 数据库（https://stringdb.org/），设置蛋白物种为“homo sapiens”，限定置信指数为0.4，隐藏游离蛋白，得到蛋白互作（PPI）网络图；将蛋白互作关系TSV 格式文件保存，利用R 软件3.6.2 计算主要蛋白之间的互作次数，并筛选出金银花-贯众药对治疗COVID-19排名前20 的核心靶点，构建相关条形图。

1.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路分析

使用R 软件3.6.2 筛选P值≤0.05 的显著途径，对疾病与药物交集靶点进行GO 生物学过程富集分析和KEGG 通路注释分析，生成柱状图和KEGG 通路图，结合文献检索，预测金银花-贯众治疗COVID-19 的主要信号通路。

2 结果

2.1 金银花-贯众活性成分和潜在靶点

通过TCMSP 数据库及相关文献检索，以OB ≥30% 且和DL ≥0.18 为筛选标准进行筛选后得到金银花19 种活性成分包括quercetin、luteolin、beta-sitosterol 等，贯众7 种活性成分Harmonyl、11-Hydroxynumantenine 等。其中山柰酚（kaempferol）为金银花、贯众共有活性成分。

2.2 COVID-19 潜在靶点

通过以“novel coronavirus”为检索词，分别在GeneCards，OMIM 数据库进行检索，共收集到COVID-19 潜在基因靶点309 个，与金银花活性成分潜在靶标进行对比，共有43 个共同基因靶点。

2.3 成分-靶点网络

将药物的主要成分及其对应靶点导入Cytoscape3.7.2 构建活性成分-预测靶点网络，节点分别代表疾病、药物及其活性成分、对应基因靶标，其中山柰酚（kaempferol）为金银花、贯众共有活性成分。通过分析成分-靶点网络图，得到该网络中与靶点关系最为密切的前四种化合物，分别为：山柰酚（Kaempfero）、槲皮素（Quercetin）、木樨草素（Luteolin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）。

2.4 PPI 网络构建

将上述43 个共同靶点导入String 数据库，得到蛋白网络互作图，1 个节点代表1 个基因蛋白，按照节点的多少，导入R 软件3.6.2，通过计算得到排名前二十的基因靶点条形图，包括白介素家族（IL1B、IL2、IL4、IL6、IL10、CXCL8）、CCL2、IFNG、丝裂原活化蛋白激酶家族（MAPK1、MAPK8、MAPK14）等，这些基因靶点可能在金银花-贯众治疗COVID-19 中发挥着关键的作用。

2.5 靶点基因GO 富集分析

使用R 软件对金银花- 贯众药对与COVID-19 的共同靶点进行GO 功能富集分析，共富集出79 个GO 条目（P≤0.05），选取P值最小的前15 个GO 条目作气泡图，由此推出，金银花-贯众主要参与细胞因子受体结合、受体配体活性、趋化因子活性，MAP 激酶活性、抗氧化活性等生物学过程而发挥治疗作用。

2.6 KEGG 通路富集分析

通过R 软件进行KEGG 通路富集分析，共富集出146 条信号通路（P≤0.05），筛选出富集基因数较多的前20 条通路，其中可能与COVID-19 有关的信号通路主要包括：IL-17信号通路、Toll 样受体信号通路、C- 型凝集素受体信号通路、TNF 信号通路、NF-κB 信号通路等炎症相关信号通路；甲流、乙肝、麻疹、巨细胞病毒等病毒相关通路；百日咳、肺结核等细菌相关通路；美国锥虫病、弓形虫病等寄生虫相关通路；HIF-1 信号通路等。结合相关文献发现，炎症相关通路、HIF-1 信号通路可能在金银花-贯众治疗COVID-19 发挥着重要作用。

3 讨论

COVID-19 爆发至今，我国在2019 新冠肺炎疫情战中采取了一系列严格彻底的防控措施，不仅为世界新冠疫情控制争取了时间，也为各国新冠疫情战争提供了宝贵的经验。当前各国新冠肺炎疫苗在紧张的研制中，至今仍未发现治疗的特效药，我国专家据我国疫情情况，在阻击疫情过程中合理、辨证的使用中医药，有效的改善了COVID-19 的预后率。COVID-19 的发病与外感疫厉之邪相关，金代刘完素所著《伤寒直格》云 :“伤寒六经传受，自浅至深，皆是热证，非有阴寒之病”，提出“六气皆从火化”的理论，由此佐证，火热、火毒在COVID-19 病程中发挥着重要的作用，故金银花-贯众等清热解毒类中药在临床使用频次较高。

通过网络药理学对金银花-贯众主要有效成分进行相关靶点筛选，共筛选出金银花19 种活性成分，贯众7 种活性成分，根据成分-靶点的作用关系，筛选出作用较强的4 个化合物：山柰酚、槲皮素、木樨草素、β-谷甾醇。山奈酚具有抗氧化活性，可清除氧自由基，也可通过降低MAKP 信号通路的活性来抑制TNF、IL-6、IL-10、IL-1β 等的表达水平，发挥抗炎作用，进而改善因组织缺氧引起的损伤[7-8]。槲皮素可减轻肺组织的水肿和病理损伤，抑制细胞的炎症反应。槲皮素除激活自噬活性外，还通过抑制促纤维化因子和AKT/mTOR 信号通路显示抗纤维化活性。β-谷甾醇可以抑制NF-κB 信号转导通路的激活，可能是其减轻急性肺损伤的机制之一。木犀草素通过对MAPK 激活，p65 激活，对p65 易位和与DNA结合的调节抑制，抑制NF-κB-DNA 结合活性。综上金银花-贯众主要活性成分具有抗病毒、抗炎、抗肺纤维化和调节免疫等功能，从而起到治疗和预防COVID-19 的作用。

筛选出金银花-贯众治疗COVID-19 的直接靶标43 个，通过蛋白互作网络分析发现白介素家族（IL1B、IL2、IL4、IL6、IL10、CXCL8）、CCL2、IFNG、丝裂原活化蛋白激酶家族（MAPK1、MAPK8、MAPK14）、PTGS2 等靶点可能是金银花-贯众治疗COVID-19 关键靶标。白介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，具有传递信息、激活或免疫调节等功能。IL-1B 主要由单核细胞和巨噬细胞产生，具有上调促炎性细胞因子和趋化因子的分泌的功能，并具有诱导环氧合酶（COX）-2 表达的作用。COVID-19 与Toll 样受体（TLR）结合导致pro-IL-1B 的释放，并被caspase-裂解，随后活化并产生成熟的IL-1B，IL-1B 能介导肺部的炎症、发热和肺纤维化，并引起严重的呼吸道疾病。亦有实验证明，IL-1B 是驱动肺损伤患者支气管肺泡灌洗液促炎活性的关键细胞因子。IL-6 在机体的抗感染免疫中起着重要的作用，有研究表明，COVID-19 危重患者的炎症细胞因子IL-6 水平显着升高。IL-10 表达的增加会诱导胶原蛋白的产生和向肺中募集纤维细胞，与肺纤维化相关。CCL2 是能够趋化细胞定向移动的小分子细胞因子，在参与炎症反应、病原体感染、创伤修复inflammation, proliferation, and remodeling. An alteration at any stage may lead to the development of chronic non-healing wounds or excessive scar formation. Impaired wound healing presents a significant health and economic burden to millions of individuals worldwide, with diabetes mellitus and aging being major risk factors. Ongoing understanding of the mechanisms that underly wound healing is required for the development of new and improved therapies that increase repair. Chemokines are key regulators of the wound healing process. They are involved in the promotion and inhibition of angiogenesis and the recruitment of inflammatory cells, which release growth factors and cytokines to facilitate the wound healing process.Preclinical research studies in mice show that the administration of CCL2, CCL21, CXCL12, and a CXCR4 antagonist as well as broad-spectrum inhibition of the CC-chemokine class improve the wound healing process. The focus of this review is to highlight the contributions of chemokines during each stage of wound healing and to discuss the related molecular pathologies in complex and chronic non-healing wounds.We explore the therapeutic potential of targeting chemokines as a novel approach to overcome the debilitating effects of impaired wound healing.”,”container-title”:”International Journal of Molecular Sciences”,”DOI”:”10.3390/ijms19103217”,”ISSN”:”1422-0067”,”issue”:”10”,”journal Abbreviation”:”Int J Mol Sci”,”language”:”eng”,”note”:”PM ID: 30340330 PMCID: PMC6214117”,”source”:”PubMed”,”ti tle”:”The Role of Chemokines in Wound Healing”,”volume”:”19”,”author”:[{“family”:”Ridiandries”,”given”:”Anisyah”},{“family”:”Tan”,”given”:”Joanne T. M.”},{“family”:”Bursill”,”given”:”Christina A.”}],”issued”:{“date-parts”:[[“2018”,10,18]]}}}],”schema”:”https://github.com/citation-style-language/schema/raw/master/csl-citation.json”} 及肿瘤形成等病理过程中发挥着重要作用。动物实验表明，CCL2 参与抗原诱导的肥大细胞募集至致敏和小鼠肺损伤。干扰素是一类具有抗病毒，抗肿瘤和免疫调节作用的低分子糖蛋白质，是机体抗病毒感染的第一道天然免疫防线，现主要分为I 型、II 型、III 型，其中I 型又分为INF-α 和INF-β，已有实验证明，IFN-β1a 对SARS-CoV有很好的抑制作用。由于机体在遭受病原体入侵或毒素刺激时，体内炎症细胞会释放大量炎症介质和细胞毒素，内源性炎症介质如IL-6、IL-8、TNF-α 等进入循环可能产生细胞因子风暴，据报道白介素、干扰素、趋化因子可能在细胞因子风暴中发挥着核心的作用。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一族在真核生物中广泛存在的丝/苏氨酸蛋白激酶，能调节宿主对感染的免疫反应，能被多种病毒激活。PTGS2（前列腺素内过氧化物合酶2）即环氧合酶2（COX-2），主要在炎症组织中由细胞因子和炎症介质诱导产生。在外界刺激因子的作用下，COX-2 促使炎症介质前列腺素的合成并引起炎症反应、发热和疼痛，催化花生四烯酸（AA）转化为病理性前列腺素（PGs）。病毒感染会刺激COX-2mRNA 的积累，蛋白质表达和PGE2 的产生，参与调节宿主对感染的反应、病毒的复制生命周期或增强病毒感染的机制。

KEGG 富集结果显示，金银花-贯众治疗COVID-19 可能与IL-17 信号通路、TNF 信号通路、甲型流感、Toll 样受体信号通路、C 型凝集素受体信号通路、HIF-1 信号通路、NF-κB 信号通路等信号通路有关。其中Toll 样受体信号通路（TLRs）可识别不同的病原体相关分子模式，是抵御病原体入侵的第一道防线。TLR 信号转导通路的激活来源于细胞内Toll/IL-1 受体(TIR)的结构域，该结构域与TIR 结构域包含的接头蛋白MyD88 发生相互作用，经过配体的刺激，MyD88将IL-1 受体相关激酶-4(IRAK-4)吸引到Toll 样受体，从而激活MAP 激酶(JNK,p38MAPK) 和NF-κB。TNF 是一种糖蛋白，由TNF-α、TNF-β 组成，胞外因子TNF-α 以三聚体形式发挥信号转导功能，与TNF 受体（TNFR）结合引起受体多聚化，这种多聚化使得TNF 受体与细胞质中TRADD 分子发生相互作用，TRADD 招募相应蛋白通过TRAF2 和RIP 分子激活NF-κB 信号通路。NF-κB 负责编码促炎性细胞因子和趋化因子的基因转录。由此得出NF-κB 可能在金银花-贯众治疗COVID-19 信号通路中起着关键作用，进而介导下游IL-6、IL-1B 等炎症因子的释放。HIF-1（缺氧诱导因子1）是一种可响应细胞环境中可用氧变化的重要转录因子。它有两个亚基，HIF-1α 和HIF-1β，HIF-1α 受氧状态调节在缺氧条件下积累表达。最近研究发现，HIF-1α 缺乏会通过促进II型肺泡上皮细胞自噬来增强甲型流感病毒的复制。

综上所述，本文采用网络药理学的方法对金银花-贯众治疗COVID-19 的分子机制进行探讨。结果显示，金银花-贯众中的山柰酚（Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）、木樨草素（Luteolin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）可能通过IL-17 信号通路、TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路、HIF-1 信号通路等通路作用于IL1B、IL6、IL10、CXCL8、CCL2、IFNG、PTGS2 等作用靶点发挥抗病毒、抗炎、抗缺氧等作用来治疗COVID-19，为后续实验验证提供一定的理论依据。