IL-12抗肿瘤非临床药效学研究进展

陈丽娜，王亚俊，丁会芹，吴明远，王建刚，刘大庆，张 辉

（1.康立泰药业有限公司，山东 青岛 266112；2.山东省药学科学院，山东 济南 250101）

白介素12（IL-12）是具有多重免疫调节功能的细胞因子，研究表明其能通过调节固有免疫、获得性免疫及肿瘤血管生成过程发挥抗肿瘤作用[1-2]。固有免疫方面，IL-12的P40亚基可作为巨噬细胞的趋化因子，趋化巨噬细胞向肿瘤部位移动，增强免疫应答，发挥抗肿瘤作用。获得性免疫方面，IL-12作为在Th1细胞分化和Th1型细胞因子介导的肿瘤免疫和炎症免疫中发挥作用的最重要细胞因子[3]，能诱导NK细胞和T细胞产生γ干扰素（IFN-γ），IFN-γ能上调MCH-I/II类分子、细胞间黏附分子1（ICAM-1）等黏附分子及T-bet等转录调节分子的表达，并能反馈性上调产生内源性IL-12，进而发挥抗肿瘤作用。国内外已有较多研究均明确阐述了IL-12在抗肿瘤方面的有效性[4-8]。因此，本文就IL-12单药抗肿瘤，以及联合放化疗、免疫治疗等治疗方式联合抗肿瘤的动物药效学研究做一综述。

1 IL-12单独用药对荷瘤动物模型的药效学研究

1.1 IL-12对黑色素瘤转移的肺癌、肝癌、网状细胞肉瘤及肾细胞癌的抑制作用

Gately等[9]研究了IL-12在小鼠体内的抗肿瘤及抗肿瘤转移活性，证实了IL-12对黑色素瘤转移的肺癌、肝癌、网状细胞肉瘤及肾细胞癌的抑制作用。首先评价IL-12对B16F10黑色素瘤在肺部转移的抑制作用。静脉注射肿瘤细胞后，C57BL/6小鼠从种瘤后第1天开始，一周5次腹腔注射不同剂量的IL-12，共3周。结果表明，肿瘤转移数量呈现剂量相关性，1 μg剂量组（41个）与溶剂对照组（200个）差异有统计学意义（P＜0.005）；另一组已转移肿瘤试验中，1 μg剂量组与对照组相比，肿瘤转移数量差异仍有统计学意义（P＜0.0005）。结果表明，IL-12有潜在的抗肿瘤活性，且这种活性在有明确的肿瘤转移后仍可体现。其次，IL-12对皮下已生长B16F10肿瘤的抑制性也有剂量相关性，未出现显著相关毒性。继续给药至第50天，小鼠肿瘤生长被一定程度地抑制，极大地延长了小鼠的存活时间。

IL-12对M5076网织细胞肉瘤的生长及肝转移的抑制作用评价试验结果表明，溶剂对照组的中位生存期为21 d，并在第26天小鼠全部死亡；IL-12给药组的中位生存期为38 d。另外皮下注射M5076肿瘤细胞后，肿瘤的发展慢于皮下注射B16F10细胞，因此，给予IL-12治疗在种植肿瘤细胞4周后开始。IL-12仍显著减缓了肿瘤生长，自发的肝转移也被有效抑制。上述结果表明，IL-12可抑制M5076网织细胞肉瘤在皮下的生长以及肝转移。

腹腔注射IL-12对小鼠肾细胞腺癌肿瘤未完全消失，但有显著的抑制效果。将IL-12注射于癌周则肿瘤抑制效果非常显著，60 d后检测结果表明，IL-12给药组有70 %的小鼠未检测到肿瘤。上述结果表明，IL-12有抗肾细胞腺癌的活性，且在一定情况下，可导致已形成肿瘤消失。

1.2 IL-12对结肠腺癌、肉瘤的抑制作用

Nastala等[10]研究发现重组白介素12（rIL-12）可诱导IFN-γ的产生从而导致肿瘤凋亡。C57BL/6小鼠腹腔种植MCA-105及MC-38肿瘤细胞后，给予IL-12可使肿瘤细胞消亡，并且延长小鼠生存期。IL-12单独使用或与IL-2联合应用抗MC-38肿瘤转移结果表明，建立肺部肿瘤转移模型后10 d给予IL-12（1.0 μg/d），微小转移肿瘤明显被抑制。相比于IL-2对照组，虽然IL-2给药组也产生了显著的肿瘤抑制作用，但毒性反应较大；低剂量的IL-2及IL-12联用在本试验条件下未显现出更好的抗肿瘤效果。以上结果均证实了IL-12对结肠腺癌、肉瘤较好的抑制作用。

1.3 IL-12对纤维肉瘤、卵巢癌的抑制作用

IL-12对3种肿瘤模型的抑制作用研究[11]，包括病毒诱发的CSA1M纤维肉瘤，辐射导致的OV-HM卵巢癌及化学致癌的MCH-1-A1纤维肉瘤。CSA1M和OV-HM肿瘤在经过系统的IL-12治疗后完全消失，这种治疗方式甚至对生长50 d的大CSA1M肿瘤消亡也是有效的。OV-HM卵巢癌有较强的转移性，在小鼠种植肿瘤细胞一个月后即可自发向淋巴结和肺部转移形成微小肿瘤，但经IL-12治疗后，小鼠的原生OV-HM肿瘤完全消失，且未观察到有肿瘤转移发生。结果表明，IL-12对于OV-HM模型在消除原生肿瘤的同时还可抑制肿瘤转移。但对于MCH-1-A1纤维肉瘤虽有肿瘤被抑制的情况，但没有引发肿瘤消亡。结果表明，对于不同的肿瘤模型，IL-12的抗肿瘤效应可能是不同的。IL-12抗肿瘤机制及影响IL-12功效的因素仍需进一步深入探索。

1.4 IL-12对淋巴瘤的作用

Verbik等[12]评价了IL-12对淋巴瘤的作用效果，BALB/c小鼠种植1×103 RAW117-H10淋巴瘤细胞24 h后，腹腔注射给予IL-12。肿瘤种植后第16天，对照组的小鼠全部死于肝脏和肺部巨大的肿瘤负荷；而肿瘤种植60 d后处死给药组小鼠，病理照片显示，0.350 μg给药组小鼠没有在肺部或肝部出现肿瘤小结节。结果表明，IL-12能有效提高淋巴瘤小鼠的总生存率，并有效抑制肿瘤转移。

1.5 IL-12对乳腺癌的作用

Boggio等[13]评价了在肿瘤早期、晚期及长期给药IL-12对小鼠乳腺癌发展的影响，将过度表达HER-2/neu致癌基因的转基因BALB/c小鼠（BALB-neu T小鼠）及携带HER-2/neu原癌基因的FVB小鼠（FVB-neu N小鼠）随机分组，每周检查乳腺及肿块情况＞3 mm即确认为肿瘤。试验结果发现，IL-12可推迟BALB-neu T小鼠乳腺癌的发生。评价了FVB-neu N小鼠接受IL-12治疗乳腺癌发展的情况，在确认肿瘤形成后第6周、第22周和第28周腹腔注射IL-12。6周给药组、22周给药组与对照组相比，在肿瘤增殖及无瘤率方面，均存在显著性差异，但第28周给药组与对照组相比无显著差异。以上结果提示，对肿瘤的抑制作用似乎主要依赖于IL-12干预早期肿瘤血管生成的能力。

1.6 IL-12对膀胱癌的作用

O’Donnell等[14]研究了IL-12在小鼠膀胱癌模型中的作用，MB49细胞和MBT2细胞肿瘤模型给药试验结果均表明，IL-12对膀胱癌的抑制作用为剂量相关的；在一个MB49肿瘤模型给药试验中，于第3，5，7，9和11天给予IL-12 250 ng，小鼠肿瘤完全消失，且在到试验结束的180 d内，无肿瘤生长迹象。

研究者进一步探索，将上述试验中存活的C57BL/6J小鼠再次接种MB49肿瘤细胞，于第7天后给予IL-12，给药剂量为500/1000 ng，一周5次，共2周。当发现肿瘤生长直径大于2 cm时，将小鼠处死。结果发现，给药组与对照组相比，小鼠存活率有显著差异；于第105天后给经IL-12治疗的存活小鼠再次接种MB49肿瘤，并不再给予IL-12，最初1000 ng给药组存活的小鼠在此次试验中有了更高的存活率，表明给予IL-12可产生免疫保护。

2 IL-12与放化疗或其他肿瘤治疗方法联合应用的药效学研究

早期的非临床研究显示IL-12单药在抗肿瘤非临床研究中具有很好的治疗效果，但是临床药效却并不明显，并且引发了严重的不良反应。因此，研究尝试将IL-12与其他癌症治疗方法联用，如抗体、肿瘤疫苗、其他细胞因子、化疗及放疗等。

2.1 IL-12与放化疗联合治疗肿瘤

在多种动物肿瘤模型中，IL-12和环磷酰胺联用产生了比IL-12或环磷酰胺单独使用均更优的抗肿瘤效应。

一项小鼠肉瘤和结肠癌肿瘤模型研究证实[15]，在多次的化疗周期中，免疫刺激缺乏而非内在肿瘤细胞的耐药性，是抗肿瘤反应丧失的原因。该研究还发现，无论肿瘤是否有免疫原性，在化疗周期中加入IL-12可保持甚至促进抗肿瘤反应，并显著延长小鼠生存期。有些肿瘤负荷较大的小鼠，在第一次环磷酰胺和IL-12联合治疗复发后，给予第二次治疗（治疗方案、剂量与第一次相同）可完全清除肿瘤。分析表明，在第一个治疗周期后，两种药物联用提高了宿主的抗肿瘤免疫活性。Le等[16]研究再次证明，通过IL-12治疗而激活的抗肿瘤免疫反应，特别是环磷酰胺和IL-12组合，可对抗临床上显著的大肿瘤负担。预先存在的肿瘤致敏T细胞[15,17]对IL-12和环磷酰胺加IL-12根除已建立的肿瘤至关重要。

有研究对小鼠肿瘤放化疗后给予IL-12，取得了较好的结果[18]。试验采用C57BL/6J小鼠，种植EL4淋巴瘤或Lewis肺癌细胞，建立肿瘤模型，造模后的小鼠进行放化疗治疗，并给予IL-12。放/化疗后每3～4 d进行外周血细胞计数，并测量肿瘤大小。

（1）低剂量IL-12显著改善了亚致死剂量照射荷瘤小鼠全血细胞减少症，同时伴随肿瘤体积减小。在EL4淋巴瘤和Lewis肺癌模型中，相对于对照组，所有细胞因子治疗组在研究终点均表现为肿瘤体积整体减小；对于淋巴瘤模型，IL-12治疗（预给药、后给药或预-后给药）明显抑制了肿瘤的生长（%T/C＜50 %），但粒细胞集落刺激因子（G-CSF）效果不显著，所有治疗组对第二次辐射剂量表现出一定的敏感性。在Lewis肺癌模型中，相对于对照组，G-CSF和IL-12治疗组的肿瘤体积均减小。虽然Lewis肺癌模型中，相对于对照组，所有的细胞因子治疗组抑制了肿瘤生长，但只有IL-12预-后给药组和G-CSF组对第二剂量辐射表现出敏感性。在Lewis肺癌模型中，与对照组相比，只有IL-12后给药组肿瘤体积减少显著（%T/C＜50 %）。

（2）与单纯化疗相比，低剂量IL-12促进化疗后的荷瘤小鼠造血恢复并伴随肿瘤生长体积的抑制。在两种肿瘤模型的化疗研究观察期结束时，与单独治疗（安慰剂组）相比，IL-12联合环磷酰胺治疗使肿瘤体积显著减少（%T/C＜50 %），尤其是EL4模型，无论是IL-12预-后给药和IL-12后给药在16天观察期结束时肿瘤体积均显著减少（%T/C＜50 %）。而对于肺癌模型，在12 d观察期内，IL-12预-后给药组（分次剂量为50 ng/100 ng）和预给药组（50 ng）肿瘤体积都显著减少（%T/C＜50 %）。无论哪种肿瘤模型，G-CSF治疗未实现显著肿瘤减少，只在肺癌模型中可看到总体不显著的肿瘤体积减少。IL-12在Lewis肺癌模型中的抗肿瘤效应另一个重要部分是IL-12联合环磷酰胺在单纯基本治疗的基础上产生了显著的抗肿瘤反应，尽管事实上细胞株无免疫原性（以往报道IL-12对Lewis肺癌肿瘤模型的效应显示IL-12对这种无免疫原性的肿瘤没有抗肿瘤效果[19]）。因此，该研究IL-12预-后给药组在无免疫原性肿瘤的结果，即%T/C约34 %，表明IL-12与环磷酰胺联合改变了这种无免疫原性肺癌肿瘤模型的免疫原性。

进一步对淋巴瘤模型进行第二轮化疗及细胞因子治疗，以评估肿瘤直径＜20 mm荷瘤小鼠肿瘤的发展。环磷酰胺及佐剂细胞因子给药方式与上述相同。在第二轮化疗时，小鼠体内的可见肿瘤并未消失。因此与该小鼠模型系统的第一轮化疗相比，在第二轮环磷酰胺治疗时，表现出对细胞毒性药物明显的耐受性。人类癌症治疗中也观察到对环磷酰胺的耐受性。小鼠淋巴瘤研究中，第二轮化疗结束后，即第一轮环磷酰胺治疗后5周和肿瘤接种后7周，试验终止时IL-12预-后给药组和后给药组分别有37.5 %和50 %的小鼠无肿瘤，而安慰剂组未发现无肿瘤的小鼠。因此，在这种侵袭性淋巴瘤模型中，IL-12给药结合环磷酰胺是非常有效的治疗方法，产生的抗肿瘤效应比单纯环磷酰胺疗法更有效。

在一项硼替佐米与IL-12联合抗肿瘤的临床前研究中[20]，硼替佐米单药使用导致了肿瘤生长的显著抑制，分别在治疗15和21 d后肿瘤体积减少约65 %和约60 %。在同一时间点，硼替佐米与IL-12联合治疗则分别使肿瘤生长减少约75%和约84 %。在2周时终止硼替佐米治疗后，肿瘤恢复生长。联合治疗则完全阻止了肿瘤生长的这种反弹，且在整个过程中肿瘤体积持续减少。

2.2 IL-12与其它免疫疗法联合治疗肿瘤

基于IL-12组合免疫疗法的当前趋势通常可分为两种，一种旨在增强抗肿瘤应答，如将IL-12应用于癌症疫苗过继性T细胞疗法[21]；另一种将IL-12作为免疫治疗剂、生物治疗药等的补充，其抗肿瘤机制与IL-12单药抗肿瘤机制不同[22-23]。

最近，IL-12与单克隆抗体联合应用的动物研究获得了有希望的结果，这些单抗包括抗CTLA-4和抗PD-L1等[24-25]。IL-12（确切地说，通过注射编码IL-12的Semliki Forest病毒）联合激动剂抗CD137单抗治疗黑色素瘤和肺癌模型小鼠，也获得了增强IL-12的抗肿瘤作用[26]。值得注意的是，目前临床肿瘤学肿瘤免疫治疗策略中对表面分子的阻断和刺激单克隆抗体均进行了深入研究。有研究尝试转移编码IL-12的mRNA，OncoSec Medical（NCT03132675）也已发表肿瘤内基因电穿孔策略。初步临床数据表明，IL-12质粒联合抗PD-1单克隆抗体（pembrolizumab）和对黑色素瘤患者有效的治疗效果[27]。

3 结语

综上所述，IL-12单独用药的非临床抗肿瘤药效研究多集中在早期阶段，且抗肿瘤作用十分显著。然而，进入临床试验阶段后，IL-12单药对各类肿瘤的治疗效果并不理想，且给药剂量较大，不良反应明显。有关IL-12单独用药的疗效，未来仍需大样本量的临床前及临床研究进一步确证。研究逐步转向将IL-12与其他治疗方法联合应用，以发挥其保护和恢复造血功能、促进机体免疫、调动肿瘤免疫的同时，能抑制肿瘤生长、提高联合治疗方式的应答率的双重优势，最终在动物试验中显示出了较好的抗肿瘤效应。IL-12与放化疗及其他肿瘤免疫疗法联合使用，明显提高了药物抗肿瘤活性。鉴于IL-12在先天性和获得性免疫中的重要桥梁作用，IL-12有一定的抗肿瘤活性，尤其是作为免疫佐剂与放化疗、免疫治疗联用时，可显著抑制肿瘤生长，阻止肿瘤恶性转移，有效延长生存期。因此，IL-12与放化疗、免疫治疗及细胞治疗等的联合应用是未来抗肿瘤的主要发展方向。随着对IL-12的研究深入，IL-12将成为有重要临床意义的抗肿瘤新药。