苎麻根褐腐病防治药剂的室内筛选

陈奕坤，王吐虹，翟杨，程毅，高春生，

（中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205）

苎麻（Boehmeria nivea（L.）Gaudich）是荨麻科（Urticaceae）苎麻属的一种多年生草本植物，原产于东亚，是全世界范围内最古老的纤维作物之一［1］。在我国，各种苎麻种类变异类型和苎麻属野生种较多，栽培历史悠久，因而国际上也将其称为“中国草”。根据FAO数据库的统计，2018年我国苎麻种植面积为5.2万公顷，年产量10.4万吨，产量占全世界的97.5%。苎麻具有生长速度快、产量高、经济效益显著等特点，具有很高的利用价值：例如其纤维品质优良，被誉为“天然纤维之王”［2］；其叶和嫩梢可作为蛋白质含量高、营养丰富的饲料被广泛利用；苎麻的麻骨还可造纸，也可制造纤维板，用于家装中的家具和板壁；其地下部的根组织中含有“苎麻酸”可为药用等［3］。此外苎麻副产物的饲料化及可生产多功能麻纤维膜等多用途开发，更增加了其经济价值［4］。

苎麻根褐腐病是由钟器腐霉（Phytopythium vexans）为主引起的一种苎麻新病害［5］，目前在苎麻产区呈逐渐扩大的趋势，该病害造成苎麻“萝卜根”内部变为红褐色、表皮变为红褐色至紫黑色，严重时腐烂死亡，严重影响苎麻的生长和产量。钟器腐霉是一种重要的、寄主广泛的植物病原卵菌，隶属于卵菌纲、霜霉目、腐霉科、腐霉属。其除了为害苎麻，还能为害烟草、柑橘、茶叶等多种经济作物［6］，引发溃疡病、冠腐病、茎腐病、根褐腐病和猝倒病［7］。

目前，苎麻根褐腐病发生日益严重，但国内外缺乏有效的化学防治手段。本研究对市场上常用的杀菌剂进行收集整理，利用含毒介质法在室内进行药效筛选试验，筛选出了防治苎麻根褐腐病的高效杀菌剂，旨在为苎麻根褐腐病的田间防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试药剂

参照市场上针对腐霉菌类病害常用的药剂，选择低毒的主流杀菌剂。从市场上收集了18种供试药剂，分别为：苯菌灵、百菌清、甲基硫菌灵（甲拖）、克菌丹、溴菌腈、腐霉利、代森锰锌、啶菌恶唑、氰霜唑、霜霉威、恶霉灵、70%敌磺钠、45%敌磺钠、精甲霜·锰锌、多抗霉素B、湘特1号、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌（见表1）。

表1 供试药剂信息Table 1 Information of the supplied test fungicides

1.1.2 供试病原菌

钟器腐霉菌株HF1（中国农业科学院麻类研究所沅江实验站）；DZ1－1（四川省达州市农科所）；YC2－3（江西省宜春市农科所）；XN－2（湖北省咸宁市农科所）；FL2－1（重庆市涪陵区农科所），均通过形态学和分子生物学的方法鉴定为钟器腐霉。

1.1.3 培养基

PDA培养基：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，15～20 g琼脂，加蒸馏水至1000 mL，121°C灭菌20 min。

PARP［8］：匹马菌素＋利福平＋安卡青霉素钠＋五氯硝基苯。

匹马菌素：0.05 g溶解于20 mL DMSO，交替加无菌水与DMSO定容至50 mL。过滤除菌，分装10 mL离心管，－20°C保存。

利福平和安卡青霉素钠：0.05 g利福平溶解于1 mL DMSO，1.25 g安卡青霉素钠溶解于40 mL纯水，溶解后将两者混合，定容至50 mL，过滤除菌，分装于10 mL离心管，－20°C保存。

五氯硝基苯：0.125 g五氯硝基苯溶解于5 mL DMSO，过滤除菌，4°C保存。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离与培养

选取5个地区带有典型苎麻根褐腐病的苎麻根，清洗干净后，在无菌操作台上进行表面消毒。先对其净根表面用75%酒精擦拭2遍，然后用3%的次氯酸钠消毒5 min，再用蒸馏水清洗3遍后置于无菌滤纸上［9］。用小刀取下发病组织的病健交界处，用剪刀剪成2～3 mm方块，置于含有PARP的PDA选择性培养基平板培养皿中，之后静置于恒温培养箱中培养，温度为（25±1）°C。待分离的组织块长出菌落后，选取典型的病原菌菌落，用接种针转接到另一PDA平板中，在25°C恒温培养箱中继续纯化培养，2 d后在无菌条件下，用0.5 cm打孔器打成菌饼备用。

1.2.2 病原菌鉴定

采用北京聚合美生物科技有限公司提供的M5超光速MIX试剂盒 （MF848）提取钟器腐霉DNA，以此为模板进行PCR扩增，3%琼脂糖凝胶电泳检测。余永廷等［5］首次提出并通过形态学和分子生物学的方法确定了钟器腐霉是引起苎麻根褐腐病的病原菌，可直接通过特异性引物鉴定病原菌钟器腐霉。

（1）其特异性引物如下［10］：PvF1（5‘－TTTCCGTTTTGTGCTTGATG－3’）和 PvR1（5‘－AGCGAACACACCCAATAAGC－3’），PCR扩增产物大小为147 bp。

（2）PCR反应条件：95°C预变性 3min，95°C变性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸1min，将变性、退火、延伸设置为34次循环，最后72°C再延伸5 min。

（3）电泳条件：130 V，180 mA，30 min。

1.2.3 药剂的质量浓度筛选

采用含毒介质法［11］，所选杀菌剂参考使用说明书上提供的田间用药浓度，选择湖南省沅江市分离菌HF1进行毒力初步测定。

采用二次稀释法［12］制备含药平板。方法如下：依据每种药剂的实际工作浓度将药剂配制为母液以方便操作，母液浓度为原样浓度稀释10～20倍最佳。将事先备好的培养基加热融化并冷却，取适量母液加入蒸馏水稀释成目标浓度，并加入冷却至60°C左右的PDA培养基中，摇晃均匀，倒入9 mm的无菌培养皿。待平板凝固后，将之前保存好的钟器腐霉菌菌株进行活化后，打取菌柄置于带药平板中央，放入（25±1）℃的恒温培养箱，测量并记录菌落值。根据18种供试药剂的抑菌率，确定药效较好的几种药剂。

初试后，选取几种高效的杀菌剂，并观察其药剂在抑菌率50%上下区间范围所对应的稀释浓度，每种药剂依次从高到低选取5种浓度逐步测试，每个处理重复6次，获取质量浓度梯度曲线，求出其EC50（能引起50%最大效应的浓度）。

1.2.4 数据统计

接种后，每12 h观察一次菌丝生长情况，在对照培养皿真菌菌丝长满培养皿之前，用十字交叉法进行菌落直径测量，并利用下列公式计算抑菌率［13］。利用Excel求出浓度的对数和抑制率，计算回归方程及EC50值和相关系数：

抑制率（%）＝［（对照菌落直径－0.5 cm）－（处理菌落直径－0.5 cm）］／（对照菌落直径－0.5 cm）×100%

1.2.5 精甲霜·锰锌对5个主产区苎麻根褐腐病钟器腐霉菌毒力测定

对已筛选出的最好的高效杀菌剂精甲霜·锰锌，测定其对5个主产区苎麻根褐腐病菌的抑菌效果。配制适宜的精甲霜·锰锌浓度，采用生长速率法，在含药平板上分别接种湖北、江西、四川、重庆、湖南5地分离的钟器腐霉菌，测量其菌落直径并计算抑菌率。每个地区3次接菌重复，不加药培养基作空白对照，依次测定精甲霜·锰锌对各个地区苎麻根褐腐病菌的抑菌率。并采用SPSS 22.0进行单因素方差分析［14］。

2 结果与分析

2.1 病原菌的鉴定结果

从苎麻病根分离出的病原菌，经特异性引物PvF1和PvR1扩增，凝胶电泳条带见图1，CK为阴性对照（做PCR体系时不加DNA模板），特异性引物扩增条带为147 bp，图中目的条带与预期相符，确定已分离的5个地区根褐腐病病原菌为钟器腐霉。

图1 5个地区苎麻根褐腐病病原菌DNA特异性引物PCR扩增电泳图谱Fig.1 PCR amplification of DNA from ramie root rot in 5 regions using specific primers

2.2 室内药剂初筛试验结果

对供试钟器腐霉菌株HF1进行杀菌剂初筛，取不加任何药剂平板中的HF1生长直径为对照，表2结果表明，18种杀菌剂对钟器腐霉HF1的抑制作用存在差异，其中代森猛锌、啶菌恶唑、精甲霜·锰锌、克菌丹、溴菌腈对钟器腐霉HF1具有非常好的抑制作用，对苎麻根褐腐病菌的抑制率达100%。当对照的钟器腐霉HF1菌落直径为5.96 cm时，添加了上述5种药剂的平板上菌株完全不生长。苯菌灵、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉对钟器腐霉HF1抑制效果不明显。

2.3 杀菌剂效果数据统计

2.3.1 5种高效杀菌剂室内毒力测定分析

初筛防效较好的药剂有代森猛锌、啶菌恶唑、精甲霜·锰锌、克菌丹、溴菌腈，其杀菌毒力测定统计数据通过Excel分析，计算出5种杀菌剂的EC50值。5种杀菌剂对钟器腐霉HF1杀菌效果的线性回归方程统计分析如表3。

表2 8种杀菌剂对钟器腐霉菌株HF1的抑制率Table 2 Inhibition rate of 18 fungicides on P．vexans HF1

表3 5种杀菌剂的回归方程Table 3 Regression equation of five fungicides

从表3数据可以看出，精甲霜·锰锌的EC50最小，为1.004 mg／L，然后依次是克菌丹、代森锰锌、溴菌腈、啶菌恶唑，EC50分别为 13.740、27.830、56.260、190.570 mg／L。根据抑菌毒力回归方程，药剂的浓度和抑制率呈正相关，R体现了杀菌剂对钟器腐霉的抑菌率和杀菌剂的浓度之间呈现正相关性的密切程度，相关系数R2均在0.9～1.0之间，说明5种药剂抑菌率和杀菌剂浓度相关程度很高。数据结果同时表明，精甲霜·锰锌的抑制效果最好，其抑菌效果远高于其他药剂，其次为克菌丹、代森锰锌、溴菌腈，而啶菌恶唑的抑菌效果在5种药剂中最差。

2.3.2 精甲霜·锰锌对5个地区的钟器腐霉菌的抑菌效果及其差异显著性

测定5个主产区苎麻根褐腐病菌在精甲霜·锰锌作用下的抑菌情况，采用生长速率法，在含药平板上接菌，测量其菌落直径，重复3次，取抑菌率平均值。由表4可知，精甲霜·锰锌对5个主产区苎麻根褐腐病菌的抑菌率在93.75%～96.93%之间，其抑菌率差异不显著，不同地区的钟器腐霉菌株对同一种杀菌剂抗性无明显差异。

表4 精甲霜·锰锌对不同地区钟器腐霉菌株的抑菌率均值统计结果及差异Table 4 The statistical results and differences of themean value of the inhibitory rate ofmetalaxylmancozeb against P．vexans in different regions

3 讨论

随着经济的发展，苎麻除传统上用作纺织原料、动物饲料外，很多新的领域（如药用、生物降解薄膜等）得到开发利用。因其高市场活跃度、历史文化的深厚底蕴、特色的苎麻产区经济发展模式、广泛而优良的多功能应用途径［15］等特点，苎麻在农产品的高质量发展中有十分重要的地位。由钟器腐霉为主引起的根褐腐病作为苎麻生产上的重要病害，对其进行有效防治至关重要。本研究选取了市场上常用的18种腐霉类杀菌剂，对钟器腐霉进行毒力测定，为苎麻根褐腐病化学药剂防治提供了重要的理论参考。研究结果表明，精甲霜·锰锌的室内测定抑制效果最好，该结果与前人研究报道［16］筛选出的防治其他卵菌的有效药剂一致。研究结果为田间大面积防治苎麻根褐腐病药剂选择提供了参考依据，除精甲霜·锰锌外，克菌丹、代森锰锌、溴菌腈、啶菌恶唑在钟器腐霉生长初期的抑菌率达100%。其他如苯菌灵、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉等药剂室内测定对苎麻根褐腐病钟器腐霉几乎无明显作用，可在实际用药时规避，避免无效施药。

国内苎麻5个主产区的苎麻根褐腐病菌－钟器腐霉对精甲霜·锰锌的抗药性试验结果显示，不同地区的苎麻根褐腐病病菌对同一种杀菌剂的抗性无明显差异，这在实际用药中可以更好地预测用药效果，对其防治有一定的理论依据，也确定了精甲霜·锰锌等药剂适用于不同地区的钟器腐霉防治。在试验过程中，也进行了不同地区对其他试剂的杀菌性差异比较，其结果与精甲霜·锰锌试验结果一致。虽然精甲霜·锰锌的抑菌效果显著，但为了防止使用同一种杀菌剂形成病原菌的抗药性［17］，同时推荐代森猛锌、克菌丹、溴菌腈、啶菌恶唑药剂轮换施药。

本研究明确了室内抑制钟器腐霉有效的药剂，但是对于大田根褐腐病菌是否有效有待进一步试验研究。此外，在研究中发现不仅是钟器腐霉可导致苎麻发生病变，线虫也可导致其病变，甚至一株苎麻病变可能由两个病变因子引起［18］。故如能研制出对线虫和钟器腐霉菌均有效的杀菌剂将更有意义。