蒜苔中咪鲜胺及其代谢物残留检测方法的研究与比较

陈克云,李 玲,鞠 香,王艳丽,刘艳明

(山东省食品药品检验研究院,山东 济南 250101)

近年来互联网上流传的沸沸扬扬的“蒜苔沾毒药水”事件涉及蒜苔收获后、入库贮藏前的处理,用来蘸蒜苔的乳白色液体是一种蒜苔保鲜剂乳液,其主要成分是咪鲜胺等保鲜剂。咪鲜胺是一种广谱、高效、低毒型的咪唑类杀菌剂,常用于水果、蔬菜和蘑菇的采后处理[1-4]。

咪鲜胺可有效抑制蒜苔贮藏期霉变、老化,结合冷库贮藏可使蒜苔贮藏期延长至8个月以上,是国家允许在食品加工领域使用的保鲜剂。我国农药最大残留限量标准[5]规定了咪鲜胺在大蒜中最高残留限量为0.1 mg/kg、在黄瓜中最高残留限量为1 mg/kg,在菜苔、辣椒中最高残留限量为2 mg/kg,但尚未制定蒜苔中咪鲜胺残留量的限量要求。

有研究表明咪鲜胺是一种新的内分泌干扰物,它能引发双重作用机制[6,7],而且咪鲜胺在植物体内会发生特异性转化[8],其代谢途径见图1。咪鲜胺转化为初级代谢物BTS44595和BTS44596的过程表现为明显的解毒作用,而初级代谢物BTS44595和BTS44596代谢转化为次级代谢物BTS45186(2,4,6-三氯苯酚)的过程则表现为极显著的增毒作用[9]。有报道称2,4,6-三氯苯酚可对人类神经系统和呼吸系统产生不良影响,如慢性支气管炎、咳嗽和肺功能改变[10,11],2,4,6-三氯苯酚还具有较高的毒性、致癌性和致突变能力,它结构稳定,在环境中持久存在[12]。因此在评价咪鲜胺的生态环境效应和毒性时,不仅应考虑咪鲜胺母体的生态环境效应和生物毒性,还应特别重视咪鲜胺代谢物2,4,6-三氯苯酚的生态环境效应与生物毒性。

目前国内外对咪鲜胺及其主要代谢物的残留分析方法主要有3种:一种只能分析以游离形式存在的咪鲜胺母体的残留量[13];一种只测定咪鲜胺和毒性较大的代谢物2,4,6-三氯苯酚的残留量[14-16];还有一种利用吡啶盐酸盐水解法分析咪鲜胺及其主要代谢物(分子中含有2,4,6-三氯苯氧基的化合物)的总量[17]。常见的检测咪鲜胺的方法有气相色谱法[14,17]、液相色谱法[13]、气相色谱-质谱法[16]、液相色谱-质谱法[15]。上述方法存在前处理复杂或未能测定咪鲜胺总量或重要代谢产物残留量等缺点。

本文采用气相色谱-电子捕获检测器检测,建立了蒜苔中咪鲜胺及其代谢物残留检测的两种方法:QuEChERS方法和水解法。并比较了QuEChERS方法和水解法在测定蒜苔中咪鲜胺及其代谢物残留量方面的差异,旨在为国家制定蒜苔中咪鲜胺风险监测和风险评估提供技术支持。

图1 咪鲜胺在植物体内的代谢途径Fig.1 Metabolic pathway of prochloraz in plants

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

气相色谱仪配电子捕获检测器(ECD)(Agilent7890B,美国安捷伦公司);氮吹仪(美国Organomation公司);高速离心机(德国Sigma公司);Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司);电子分析天平(北京赛多利斯公司)。

乙腈和正己烷(农残级,德国默克公司);吡啶盐酸盐(分析纯,北京百灵威科技有限公司);石油醚、NaCl、盐酸(均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司);咪鲜胺标准物质(1 g/L,北京曼哈格公司);2,4,6-三氯苯酚标准物质(1 g/L,德国DR公司)。蒜苔为市售。

1.2 前处理方法

1.2.1QuEChERS法

称取10.00 g样品于50 mL离心管中,加入20 mL乙腈,涡旋混匀,超声15 min,加入6 g氯化钠,涡旋混匀后离心,取上清液,用含900 mg MgSO4、100 mg C18、100 mg PSA(N-丙基乙二胺)和50 mg GCB(石墨化碳黑)的QuEChERS净化管净化,离心后取10mL上清液转移至15 mL离心管中,氮吹至近干,用1 mL正己烷定容。取200 μL溶液上机检测,用于测定咪鲜胺。剩余溶液加200 μL硫酸后摇匀,静置2 h后上机检测,用于测定2,4,6-三氯苯酚。

1.2.2水解法

称取10.00 g样品于50 mL离心管中,加入20 mL乙腈,涡旋混匀,超声15 min,加入6 g氯化钠,涡旋混匀后离心,取10 mL上清液转移至25 mL玻璃比色管中,氮吹至近干。比色管中加入2.5 g吡啶盐酸盐,在220 ℃的烘箱中水解1 h,冷却后用15 mL水分3次清洗比色管,将其转移至50 mL离心管中,用25 mL石油醚萃取2次,合并有机相。将有机相氮吹至约15 mL,加入1 mL硫酸磺化,静置分层,弃去硫酸。然后用25 mL超纯水洗涤至中性,收集有机相于15 mL离心管中,氮吹浓缩至近干,用1 mL正己烷定容,上机检测。

1.3 仪器条件

色谱柱为DB-17(30 m×320 μm×0.25 μm,美国Agilent公司);进样口温度:270 ℃;检测器(ECD)温度:300 ℃。升温程序:初始温度为70 ℃,保持1 min,以30 ℃/min的速率升至250 ℃,保持8 min。进样方式:不分流进样;进样量:1 μL;载气:高纯氮气(纯度为99.999%);恒定流速:2.5 mL/min。2,4,6-三氯苯酚保留时间为5.189 min,咪鲜胺的保留时间为12.388 min。咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚的标准溶液色谱图见图2。

图2 咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚的标准溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol standard solution

1.4 理论计算方法

1.4.1QuEChERS法计算方法

咪鲜胺的总残留量通过将代谢产物转化为母体来计算。咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚的相对分子质量分别为376和197,两个化合物相对分子质量的比值保留3位有效数字即为咪鲜胺与2,4,6-三氯苯酚的转化系数[18],计算咪鲜胺总残留量的公式如下:

C=C1+1.91×C2

(1)

C代表咪鲜胺的总残留量(单位为mg/kg);C1代表试样中咪鲜胺的残留量(单位为mg/kg);C2代表试样中2,4,6-三氯苯酚的残留量(单位为mg/kg);1.91为咪鲜胺转与2,4,6-三氯苯酚的转化系数。

1.4.2水解法计算方法

因咪鲜胺标准工作溶液同样品一起水解,因此直接采用咪鲜胺标准溶液水解标准曲线定量的方式进行计算。

2 结果与讨论

2.1 QuEChERS法前处理条件的优化

2.1.1提取溶剂的优化

在蒜苔基质中进行添加回收率测定试验,分别选用乙腈、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯作为提取溶剂,QuEChERS净化后用气相色谱测定。结果发现,丙酮、乙酸乙酯作为溶剂提取后回收率较好,但色素较多,经QuEChERS净化管净化后颜色仍很重;二氯甲烷提取回收率低,通过综合考察4种溶剂的提取效率及提取液的干净程度,最终选择极性大、毒性小、穿透力强、提取效率高的乙腈作为提取剂。

2.1.2净化条件的选择

在空白蒜苔基质中添加0.2 mg/kg咪鲜胺,考察了含不同GCB量的QuEChERS净化管对净化效率的影响。结果(见图3)表明,在净化过程中,GCB的用量对蒜苔咪鲜胺的回收率有明显影响,随着GCB含量的增加,蒜苔中咪鲜胺的回收率逐渐降低。推测可能是GCB优先吸附基质中存在的色素等干扰物,随着其含量的增加,则会对目标物有一定的吸附。不含GCB和含有50 mg GCB的QuEChERS净化管均可获得最佳的回收率,考虑到色谱柱、仪器耗材使用寿命的因素,本着最大程度消除基质干扰和最低程度吸附目标物的原则,最终选择用含900 mg MgSO4、100 mg C18、100 mg PSA和50 mg GCB的净化管净化。试验发现,2,4,6-三氯苯酚出峰位置基质干扰较大,因此进一步采用加硫酸磺化的方式处理。

图3 不同GCB含量净化管对咪鲜胺及2,4,6-三氯苯酚回收率的影响Fig.3 Effects of different graphitized carbon blacks (GCB)amounts on the recoveries of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol

2.1.3定量方式的考察

考察了溶剂标准曲线与基质标准曲线在定量方面的差异。用正己烷作溶剂配制的系列工作溶液浓度与在仪器上的响应绘制的曲线做溶剂标准曲线;用空白样品经QuEChERS法前处理后的定容溶液配制的系列工作溶液浓度与在仪器上的响应绘制的曲线做基质标准曲线。结果表明,QuEChERS法测定咪鲜胺存在基质效应,其值为155%,因此应采用基质匹配标准曲线来定量。基质效应采用基质标准曲线和溶剂标准曲线斜率的比值来计算。

2.2 水解法前处理条件的优化

2.2.1水解过程的优化

标准NY/T 1456-2008中,水解过程采用的是将圆底烧瓶与冷凝管连接,并置于210～240 ℃沙浴中水解。本文利用比色管代替圆底烧瓶、烘箱替代沙浴,弃去了冷凝装置,简化了加热反应,建立了一套高通量、快速、安全便捷且灵敏度高的方法,提高了检测样品的效率,减少了试剂用量,节省了成本。

2.2.2咪鲜胺水解转化效率的考察

咪鲜胺是否完全转化为2,4,6-三氯苯酚将直接影响到水解方法的可靠性和准确度,因此本文进行了咪鲜胺水解转化率的试验。添加6份1 mg/L的咪鲜胺标准溶液于比色管中,按1.2.2节方法进行处理,用2,4,6-三氯苯酚标准曲线定量,结果表明,平均水解转化率为101.2%,说明咪鲜胺得到了完全的转化,证明该方法是可行的。

2.2.3定量方式的考察

水解法标准曲线考察了3种方式:2,4,6-三氯苯酚的溶剂标准曲线、咪鲜胺标准溶液水解标准曲线和基质匹配添加咪鲜胺标准溶液后水解标准曲线。结果表明,3种方式定量均无差异,水解法不存在基质效应。日常检验参照NY/T1456-2008使用咪鲜胺标准溶液水解标准曲线定量的方式。

2.3 仪器条件的优化

标准NY/T 1456-2008中进样口温度为240 ℃,在此仪器条件下,2,4,6-三氯苯酚响应较好,而咪鲜胺响应较低。试验发现,进样口温度的设定对咪鲜胺的峰形和检测灵敏度有显著影响,对2,4,6-三氯苯酚影响不大。进样口温度过低,待测物不能有效地汽化,容易导致待测物被吸附在进样口;而进样口温度过高,容易导致咪鲜胺发生高温分解。升高进样口温度有助于提高灵敏度,在合理的范围内(温度为250～300 ℃)选择的汽化温度越高,高沸点物质的挥发程度越大,会进入色谱柱造成污染,而且进样口温度过高对色谱柱有一定损害,因此在能满足汽化需要的前提下,尽量选择较低温度,使高沸点物质尽可能地保留在进样口玻璃衬管中,最终选择270 ℃为最佳进样口温度。不同进样口温度对咪鲜胺峰面积的影响见图4。

图4 不同进样口温度对咪鲜胺响应的影响Fig.4 Effects of different injection temperatures on the response of prochloraz

2.4 方法学考察

2.4.1线性范围、检出限及定量限

水解法咪鲜胺标准工作液的制备:移取1 mL咪鲜胺标准物质,用丙酮定容至100 mL,配制成10 mg/L的标准储备液,再移取不同体积的咪鲜胺标准储备液,按照1.2.2节方法水解净化后,配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mg/L咪鲜胺标准工作溶液。按1.3节的条件测定,以咪鲜胺峰面积(y1)为纵坐标,以其质量浓度(x1,mg/L)为横坐标绘制标准曲线,得到咪鲜胺的线性方程及相关系数r2。

表1 咪鲜胺及其代谢物的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 1 Linear equations,r2,LODs,and LOQs for prochloraz and its metabolites

y1:response of prochloraz using hydrolysis method;y2:response of prochloraz using QuEChERS method;y3:response of 2,4,6-trichlorophenol using QuEChERS method;x1:mass concentration (mg/L)of prochloraz using hydrolysis method;x2:mass concentration (mg/L)of prochloraz using QuEChERS method;x3:mass concentration (mg/L)of 2,4,6-trichlorophenol using QuEChERS method.

表2 咪鲜胺及其代谢物的平均添加回收率及相对标准偏差(n=6)Table 2 Average spiked recoveries and RSDs of prochloraz and its metabolites (n=6)

QuEChERS法中咪鲜胺及其代谢物标准工作液的制备:用不含咪鲜胺及其代谢物的空白样品提取液来配制咪鲜胺及其代谢物标准溶液。按1.3节的条件测定,分别以咪鲜胺及其代谢物的峰面积(y2、y3)为纵坐标,以其质量浓度0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mg/L为横坐标(x2、x3,mg/L)绘制标准曲线,得到咪鲜胺及其代谢物的线性方程及相关系数r2。在优化的前处理条件下,通过空白样品加标试验确定方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ),具体见表1。

2.4.2精密度和回收率

称取不含目标物的蒜苔,分别添加3个水平的咪鲜胺及其2,4,6-三氯苯酚的混合标准溶液,按所建立的方法进行测定。每份样品进行6次平行测定,考察方法的回收率和精密度。由表2可知,两种方法的回收率为81.5%～105.4%,相对标准偏差(RSD)为1.3%～6.8%,该方法具有较好的可靠性。

2.5 水解法与QuEChERS法在测定阳性样品方面的差异

利用水解法及QuEChERS法对10份阳性蒜苔样品中咪鲜胺及其代谢物残留进行检测分析,测定结果见表3。结果表明,QuEChERS法测定值低于水解法,推测其原因可能是QuEChERS法前处理只分析了以游离形式存在的咪鲜胺母体及2,4,6-三氯苯酚,而对咪鲜胺在植物体内形成的其他代谢产物及其轭合残留物未做检测;吡啶盐酸盐水解法可以将以游离形式及轭合形式存在的咪鲜胺母体及其代谢物全部转化为2,4,6-三氯苯酚来测定,更加全面地检测出样品中咪鲜胺及其代谢物的总量,但无法测得咪鲜胺及其主要代谢物的存在形式和各自的含量。目前,其他3种中间代谢物的毒性未见报道,而关注较多、毒性较大的代谢产物2,4,6-三氯苯酚的含量则具有重要的指示意义。

表3 蒜苔中咪鲜胺的分析结果Table 3 Analytical results for prochloraz in garlic bolting

3 结论

本文建立了水解法、QuEChERS法两种方法测定蒜苔中咪鲜胺及其代谢物的残留量,并对这两种方法的差异进行了比较。结果表明,两种方法准确度和精密度高,且具有较高的灵敏度,均符合方法学验证要求。在测定阳性样品时,水解法可以测定以游离形式及轭合形式存在的咪鲜胺母体及其代谢物的总和,但不清楚其各自的存在形式及含量。QuEChERS法可以准确测定咪鲜胺及其重要代谢产物2,4,6-三氯苯酚的存在形式及含量,但无法测定咪鲜胺及其代谢产物的总量。两种方法相辅相成,为国家风险监测、风险评估提供技术支持,为制定蒜苔中咪鲜胺的最大残留限量、控制风险奠定了基础,更好地服务监管。