莪术联合放疗对宫颈腺癌Hela细胞凋亡的影响

赵悦辰,郭 杰,李云峰,邱 玲,孙 婧,周剑烽,王铁君

(吉林大学第二医院 肿瘤放疗科，吉林 长春130041)

宫颈癌是全球女性最常见的癌症之一，也是女性癌症高死亡率的原因之一。近年来，随着放疗技术的进步，同步放化疗已成为局部中晚期宫颈癌的标准治疗方法[1,2]。然而，局部中晚期宫颈癌放疗后仍有约30%-40%发生局部复发、转移、恶性加重等[3,4]。这可能与肿瘤在放疗期间产生放射抗性有关，放射抗性的产生是临床肿瘤放疗的主要障碍。因此，提高肿瘤细胞的放射敏感性，寻找高效的肿瘤放疗增敏药物是宫颈恶性肿瘤放射治疗的关键[5]。

莪术油为莪术蒸馏所得的挥发油，为中药莪术的主要有效成分。既往研究证实莪术油有较强的抗肿瘤作用，可直接抑制、破坏肿瘤细胞，还可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成、增强机体对肿瘤的免疫作用[6,7]。但对于莪术油的放射增敏作用的研究尚属空白。本研究欲探究莪术油联合放疗对宫颈癌Hela细胞增殖的抑制作用及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

宫颈癌细胞系HeLa细胞贴壁生长，用含有10%胎牛血清、1%抗生素-抗有丝分裂溶液的MEM培养基，在湿度为95%、37℃、含5%CO2条件下培养。每2天换一次液，细胞生长至80-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。

1.2 照射条件

使用X射线生物辐照仪以1.020 Gy/min(180 kV；20 mA)的剂量率进行照射，靶皮距70 cm。根据设立各组别不同，给予不同照射剂量。

1.3 CCK-8法

1.3.1检测不同浓度莪术油注射液对Hela细胞生长的抑制作用

将 2×104/ml细胞接种于96孔板，每孔100 μl，贴壁生长后给予10-50 μg/ml浓度莪术油与MEM培养基预混液处理，每种浓度平行 3 孔，设立空白对照。各组分别在加药后 24、48 h后弃上清后，每孔加入 100 μl CCK-8试剂与MEM培养基1∶9配制的预混液，继续孵育 4 h。用酶标仪测量在450 nm 波长下各组吸光度，计算细胞相对活力。

1.3.2检测莪术油联合放疗对Hela细胞的抑制作用

将5×104/ml细胞接种于96孔板，每孔100 μl。设立空白组，单药组、6Gy照射组、10Gy照射组、药物+6Gy照射组、药物+10Gy照射组。贴壁生长后，单药组、药物+6Gy照射组、药物+10Gy照射组给予30 μg/ml浓度莪术油注射液与MEM培养基预混液处理，其他组给予MEM培养基，每孔100 μl，每组设3平行样。孵育24 h后，6Gy照射组、药物+6Gy照射组给予6Gy X线照射，10Gy照射组、药物+10Gy照射组给予10Gy X线照射，照射条件如上所述。继续孵育24 h后，各组弃上清液，每孔加入100 μl CCK-8试剂与MEM培养基1∶9配制的预混液，孵育 4 h。用酶标仪测量在450 nm 波长下各组吸光度，计算抑制率。

1.4 流式细胞分析

设立空白组，单药组、6Gy照射组、10Gy照射组、药物+6Gy照射组、药物+10Gy照射组。贴壁生长后，单药组、药物+6Gy照射组、药物+10Gy照射组给予30 μg/ml浓度莪术油注射液与MEM培养基预混液进行培养，其他组给予MEM培养基培养。孵育24 h后，6Gy照射组、药物+6Gy照射组给予6Gy X线照射，10Gy照射组、药物+10Gy照射组给予10Gy X线照射，照射条件如上所述。继续孵育24 h后，吸去培养液，无EDTA胰酶消化6 min后，加原培养液终止消化。各组细胞2 000 r·min-1，4℃条件下离心5 min，弃上清，加入 1 ml冷的 PBS，清洗细胞2次，轻轻震荡使细胞悬浮，2 000 r·min-1，4℃离心5 min。加入1 ml Buffer使细胞重悬，计数，稀释至1×106个/ml。各组取100 μl体积细胞悬液，加入流式管中，每管分别加入2 μl PI和2 μl FITC染液轻轻混匀，避光室温反应 15 min。加入 200 μl Buffer，1 h 内上机检测。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 CCK-8法检测不同浓度莪术油注射液对Hela细胞生长的抑制作用

分别给予浓度为10，20，30，40，50 μg·ml-1的莪术油注射液，作用24 h、48 h后Hela细胞生长均受到抑制(P<0.05)，且细胞抑制率与药物浓度相关(P<0.05)，呈剂量依赖关系(表1，图1)。

表1 CCK-8法检测不同浓度莪术油注射液对Hela细胞生长的抑制作用

图1A 不同浓度莪术油作用24 h后细胞相对活力 图1B 不同浓度莪术油作用48 h后细胞相对活力

2.2 CCK-8法检测莪术油联合放疗对Hela细胞生长的抑制作用

与空白对照组相比，单药组、6Gy照射组、10Gy照射组、药物+6Gy照射组、药物+10Gy照射组细胞生长均受到抑制(P<0.05)。表2、图2中，与6Gy照射组相比，药物+6Gy照射组细胞抑制率升高(P<0.05)；与10Gy照射组相比，药物+10Gy照射组细胞抑制率显著升高(P<0.05)。表明在莪术油的作用下，宫颈癌Hela细胞的放射敏感性增强。表2中，药物+6Gy照射组细胞抑制率高于10Gy照射组(P<0.05)，表明在莪术油作用后使Hela细胞在6Gy照射条件下的增殖抑制率高于单独10Gy照射。

图2 莪术油联合放疗对Hela细胞的抑制作用

表2 CCK-8法检测莪术油联合放疗对Hela细胞生长的抑制作用

2.3 流式细胞术检测莪术油联合放疗对Hela细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果如图3。与空白组对照相比，各组处理后Hela细胞凋亡率不同程度增加(P<0.05)。其中，与6Gy照射组相比，药物+6Gy照射组细胞凋亡率升高(P<0.05)；与10Gy照射组相比，药物+10Gy照射组细胞凋亡率升高(P<0.05)。以上可见，在莪术油的作用下，经过电离辐射后的宫颈癌Hela细胞的凋亡率显著升高，再次证明莪术油的放射增敏作用。表3、图4中，药物+6Gy照射组细胞凋亡率高于10Gy照射组(P<0.05)，表明在莪术油作用后使Hela细胞在6Gy照射条件下的凋亡率高于单独10Gy照射。

表3 流式细胞术检测莪术油联合放疗对Hela细胞凋亡的影响

图3 流式细胞术检测莪术油联合放疗对Hela细胞凋亡的影响

图4 莪术油联合放疗对Hela细胞凋亡的影响

3 讨论

宫颈癌是全球范围内最常见的女性恶性肿瘤之一，因发病率与病死率持续攀升而备受关注。对于局部晚期宫颈癌患者，标准治疗方法是同步放化疗[8]。然而，宫颈癌细胞辐射抗性转归危像是严重制约病人预后的关键因素之一，放疗后局部复发、远处转移率高，严重影响临床疗效[2,9]。此外，宫颈癌放疗后常伴发膀胱、直肠等器官毒副反应，放射性膀胱炎、放射性肠炎等严重影响放疗患者的生存质量[10]。因此，如何最大程度杀死肿瘤细胞，提高肿瘤的控制率，同时使肿瘤周围正常组织伤害降到最低，降低正常组织器官放疗毒性反应，是目前宫颈癌放射治疗领域亟待解决的难题。

放射增敏剂可通过促进肿瘤细胞凋亡、调控细胞周期、加速DNA损伤、产生自由基等方式来增强射线对肿瘤组织的损伤，从而提高放疗疗效[5]。目前临床上常用的放疗增敏药物主要为细胞毒性化疗药物，中药制剂合成的放疗增敏药物并不多见[11]。莪术油是姜科植物根茎中提取的挥发油，具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤等多种生物学功效，其抗肿瘤作用近年来成为研究热点。过去的研究表明莪术油对多种恶性肿瘤有较好的杀伤作用，尤其是宫颈癌、子宫内膜癌等妇科恶性肿瘤[12,13]。而关于莪术油的放射增敏作用目前研究较少，莪术油联合放疗对宫颈癌Hela细胞的影响的研究目前未见报道。

在本研究中，我们首先采用CCK-8法检测不同浓度莪术油注射液对Hela细胞生长的抑制作用，发现细胞抑制率与药物浓度相关，呈剂量依赖关系。随后，我们设立空白对照组、单药组、6Gy照射组、药物+6Gy照射组、10Gy照射组、药物+10Gy照射组，通过CCK-8法和流式细胞术检测莪术油联合放疗对Hela细胞的抑制作用。我们发现，与单独照射相比，莪术油联合X线照射可使Hela细胞增殖抑制率、凋亡率显著升高。值得注意的是，药物+6Gy照射组Hela细胞抑制率、凋亡率高于10Gy照射组，表明经过莪术油处理有效提升了放射线对肿瘤的杀伤作用，在低剂量照射条件下获得优于高剂量照射的效果。在临床放射治疗中，我们可通过使用莪术油等放疗增敏药物增加肿瘤细胞放射敏感性，获得与大剂量照射相同的治疗效果，从而减少肿瘤靶区照射剂量，对于治疗耐受性较差患者、宫颈癌复发患者等，具有指导意义。

综上，本研究的结果显示，莪术油联合放疗可显著增加宫颈癌Hela细胞抑制率及凋亡率，在体外对宫颈癌Hela细胞有较好的放疗增敏作用。因此，莪术油可作为一种新型的放疗增敏剂，增加辐射抗性肿瘤的放疗敏感性，或降低正常组织的受照剂量，拥有巨大的临床应用前景。然而，鉴于目前关于莪术油放射增敏作用的研究还不够多，其在体内的作用机制还不明确，更多的研究有待于开展。