杠板归的创伤治愈作用与机制

杜金城，肖 浩，杜钢军

1.湖南中医药大学 中医学院，长沙 410208；2.河南大学药学院 药物研究所，河南 开封475004

创伤愈合是指在遭受外力作用下，机体组织损伤后涉及组织再生能力、肉芽组织增生和瘢痕形成的愈合修复过程[1]。中药对创伤治愈有使用方便、不良反应少、综合疗效好等独特的优势[2]。杠板归为蓼科蓼属植物，一年生草本，又名刺犁头、河白草、蛇不过等，广泛分布于全国各地，资源丰富[3]。杠板归味酸，入肺、小肠经 (南药《中草药学》)，有利水消肿、清热活血、解毒散瘀之功效。主治水肿、丹毒、疱疹、瘰疬、黄疸、痢疾及毒蛇咬伤等症[4]。现代药理学研究[5]发现，杠板归拥有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、止血、降血压等作用。本研究用网络药理学对杠板归的创伤治愈成分及作用靶点进行预测，并对其进行创伤治愈作用的实验验证，为进一步研究其创伤治愈成分及机制提供参考。

1 材料与仪器

1.1 药品

杠板归购自河南省开封市天济大药房，经河南大学生药教研室鉴定为杠板归(Polygonum perfoliatumL.)的地上部分。其水煎液制备方法为:称取干燥全草杠板归40 g，加800 mL 蒸馏水浸泡1 h，煎煮30 min取水煎液。重复上述过程，共煎煮3次。将3次滤液加热浓缩至1 mL相当于0.2 g原药材，冻存于-80℃冰箱，给药前蒸馏水稀释为小鼠体质量的4 g/kg。

1.2 试剂

地塞米松(辰欣药业股份有限公司，批号:H37021969)，二甲苯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号20170812)，冰醋酸 (淄博鲁中化工轻工有限公司，批号20180315)，依文思蓝(上海化学试剂采购供应站，批号E104208)。

1.3 实验动物

雌性昆明小鼠，体质量20～25 g，河南省实验动物中心提供，动物许可证号:SCXK(豫)2015-0002。

1.4 仪器

全波长酶标仪，Spectra Max iD5，美国Molecular Devices公司产品。

1.5 分析平台与软件

①TCMSP中药系统药理学数据库和分析平台(http://Isp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；②上海有机所中药与有效成分数据库(http://www.chemcpd.csdb.cn/scdb/main/tcm_introduce.asp)；③PubChem 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；④Swiss TargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)；⑤STITCH(http://stitch.embl.de/)；⑥GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)；⑦STRING 蛋白质相互作用分析平台(https://string-db.org/)；⑧DAVID v6.8 人类基因组注释数据库(https://david.ncifcrf.gov/)；⑨Omicshare 数据库 (http://www.omicshare.com/)；⑩Cytoscape网络图形拓扑分析与编辑软件。

2 方法

2.1 杠板归对创伤愈合的影响[6]

30只小鼠随机分为地塞米松组、杠板归组和对照组每组10只，共3组。对照组给予0.5 mL纯净水1次/d；杠板归组灌胃杠板归水煎液2 g/kg，1次/d；地塞米松组口服地塞米松5 mg/kg，1次/d。给药一周后，麻醉状态下每只小鼠脚面剪取约2 mm×3 mm 大小伤口，继续给药1次/d，并用碘伏擦洗伤口防止感染，每3 d测量伤口大小1次，记录伤口愈合程度。

2.2 杠板归对疼痛的影响[7]

分组与给药同2.1，第10 天各组给药30 min后，用1 mL 注射器往小鼠腹腔注射体积分数为0.6%的醋酸0.2 mL/10 g，记录醋酸注射10 min内每只小鼠的扭体次数。

2.3 杠板归对耳炎症的影响[8]

分组与给药同2.1，第7天给药30 min后，各组小鼠右耳正反两面滴二甲苯40μL，滴药后30 min后处死小鼠，取9 mm 打孔器打下小鼠左右耳耳片，称重，耳肿胀=右耳片重-左耳片重。

2.4 杠板归对血管炎症的影响[9]

分组与给药同2.1，第7天给药30 min后，各组小鼠腹部滴二甲苯100μL，滴二甲苯后立即尾静脉注射伊文思蓝，30 min后处死小鼠，剪取腹部染色皮肤，剪碎浸于5 mL丙酮生理盐水(7∶3)中，每天上下颠倒3次，48 h后离心取上清液，酶标仪630 nm测吸光度。

2.5 统计学方法

实验结果以均值±标准差()表示，用Graphpad prism 5.0软件进行统计学处理，其中三组之间创伤愈合程度的比较采用重复测量资料的方差分析，疼痛、耳炎症和血管炎症的比较采取两独立样本资料的t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.6 杠板归有效成分筛选和成分-靶点网络图

上海有机所化学专业数据库检索杠板归有效成分，TCMSP 数据库筛选有效成分，Pub Chem 数据库下载有效成分SDF和SMILES格式，Swiss Target Prediction和STITCH 数据库得到预测靶点，Cytoscape 3.2.1软件构建成分-靶点网络图。

2.7 炎症、疼痛治疗靶点筛选与蛋白相互作用网络(PPI)构建

以“inflammation”和“pain”为关键词在Therapeutic Target Database(TTD)中收集与炎症、疼痛相关的治疗靶点，与杠板归成分靶点进行对比，筛选出有关抗炎和镇痛治疗靶点。利用STRING 数据库得到治疗靶点蛋白相互作用关系图，构建PPI网络图，根据degree值筛出核心靶点。

2.8 GO 注释、KEGG 通路分析与成分-靶点-通路网络图构建

DAVID 数据库对GO 注释和KEGG 通路富集分析，Omicshare 对分析结果进行可视化，Cytoscape 3.2.1软件构建杠板归成分-靶点-通路网络图。

3 结果

3.1 杠板归的创伤愈合作用

本实验采用小鼠皮肤创伤模型观察杠板归的创伤愈合作用，与模型组对比，杠板归组创伤愈合较早(P＜0.05或P＜0.01)，见表1。

表1 杠板归对小鼠创伤愈合的影响

3.2 杠板归的镇痛作用

本实验采用醋酸扭体实验观察杠板归的镇痛作用，模型组小鼠扭体次数为42.1±8.7，杠板归组小鼠扭体次数为24.7±8.4，两组比较有非常显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 杠板归对小鼠耳肿胀和腹膜炎的影响

3.3 杠板归的抗炎作用

实验采用小鼠耳肿胀与腹膜炎观察杠板归的抗炎作用，与模型组比较，杠板归组小鼠耳肿胀和腹膜炎程度均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，见表2。

3.4 杠板归创伤治愈作用机制分析

根据TCMSP 数据库筛选得到12种有效成分，分别为槲皮素(quercetin)、山柰酚/3，5，7，4'-四羟基黄酮(kaempferol)、白桦脂酸(Betulinic Acid)、3，3'-二-O-甲基并没食子酸(3，3'-di-O-methylellagic acid)、白桦脂醇(betulinic acid)、熊果酸(ursolic acid)、芦荟大黄素(aloeemodin)、大黄素甲醚(Physcion)、胡萝卜苷(Daucosterol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、槲皮苷(quercitrin)、异鼠李素(isorhamnetin)、金丝桃苷(Hyperin)。这12 种有效活性成分可作用于232个靶点，其中19个是与杠板归创伤治愈相关的治疗靶点，见表3。PTGS2、STAT3、CASP3、MAPK8、BCL2、AKT1、TP53、EGFR 为核心靶点。GO 注释分析与KEGG 通路分析显示，杠板归19个治疗靶点参与79个KEGG 通路和299个生物过程(P＜0.05，count ＞7)，其中主要生物过程为 “细胞增殖”“细胞凋亡”“信号转导”“炎症反应”等。主要KEGG 通路为“MAPK 信号通路”“JAK-STAT 信号通路” “HIF-1信号通路”“PI3KAkt信号通路”“神经营养素信号通路”等。

表3 杠板归炎症治疗靶点

4 讨论

目前，从杠板归中已分离鉴定出130余种化学成分，其中主要化学成分是黄酮类物质，此外还有醌类、苯丙素类、萜类、生物碱类及其他衍生物等[10]。本文实验结果显示，杠板归有确切的促进创伤愈合作用，可以降低炎症反应和产生镇痛作用，与糖皮质激素地塞米松抗炎同时延缓创伤愈合明显不同，对创伤愈合有综合治疗作用。

本研究利用网络药理学筛出杠板归12种主要成分作用于232个靶点，其中19个基因与炎症、疼痛和损伤修复相关，EGFR、STAT3、MAPK8、BCL2、TP53、AKT1、CASP3、PTGS2为8个核心靶点，能干预“MAPK 信号通路”“JAK-STAT 信号通路” “HIF-1信号通路”“PI3K-Akt信号通路”“神经营养素信号通路”等产生抗炎、镇痛及治愈创伤作用。JAK-STAT 信号通路是与炎症密切相关的一条信号转导通路，参与免疫调节以及细胞的增殖、分化、凋亡等许多重要的生物学过程[11-12]。在JAK1/STAT3信号途径中，STAT3蛋白是转录活化因子家族和信号转导中的重要成员[13]。STAT3 可在IL-12和IL-23作用下促进炎症因子的表达[14]。因此，杠板归抗炎、镇痛、促进创伤愈合的主要机制可能与12个活性成分作用于上述信号通路中多个重要靶点有关。

综上所述，杠板归促进创伤愈合作用与其12个活性成分阻止“PI3K-AKT 信号通路”“Jak-STAT信号传导”“MAPK 信号转导通路”等以此减轻小鼠炎症和疼痛、促进蛋白质合成有关，为进一步深入研究杠板归在创伤治疗方面的应用提供了科学依据。