HPLC法测定琥珀酸美托洛尔的有关物质

许笑笑，孙 琳

1.邓州市中心医院 药械科，河南 邓州 474150；2.郑州大学 第三附属医院，郑州450000

琥珀酸美托洛尔为选择性β1受体阻滞剂，用于治疗高血压、冠心病、慢性心力衰竭和心律失常[1]。琥珀酸美托洛尔及其制剂在美国药典(USP34)和英国药典(EP2011)[2-3]均有收载，我国药典暂未收载。我们参照英国药典(EP2011)“琥珀酸美托洛尔 有关物质HPLC”项下的方法，建立琥珀酸美托洛尔有关物质的HPLC 检测方法，并参照中国药典《药品标准分析方法验证指导原则》[4]对本方法进行了验证。

1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪，AL 204电子分析天平。

琥珀酸美托洛尔原料(自制)，琥珀酸美托洛尔杂质A(008E15)。乙腈、三乙胺为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:ZORBOX-C18，150 mm×4.6 mm，5μm；流动相:醋酸铵3.9 g，用810 mL 水溶解，加三乙胺2 mL、冰醋酸10 mL、磷酸3 mL 和乙腈146 mL，混合均匀；流速:1.0 mL·min-1；柱温:25℃；检测波长:280 nm；进样量:20μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备

取琥珀酸美托洛尔20 mg，置10 mL 量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.2 对照溶液a的制备

取琥珀酸美托洛尔5 mg、琥珀酸美托洛尔杂质A 3 mg，置100 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 对照溶液b的制备

精密量取供试品溶液1.0 mL，置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀；精密量取1.0 mL，置10 mL 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 对照溶液c的制备

取琥珀酸美托洛尔10 mg，置10 mL量瓶中，用0.1 mol·L-1盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；将该溶液放置254 nm 波长的紫外灯下照射6 h；精密量取1.0 mL，置50 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。如果供试品溶液中出现一个峰面积较对照溶液b峰面积大的且出峰时间为对照溶液b主峰0.3倍保留时间的峰，进样对照溶液c，该溶液仅用于鉴定杂质C的峰。

2.2.5 计算公式

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性

按2.1项下色谱条件，量取对照溶液a 20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图至琥珀酸美托洛尔主峰保留时间的3倍。杂质A 与主峰分离度为8.85。

2.3.2 专属性

1)空白试验。取流动相20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图至琥珀酸美托洛尔主峰保留时间的3倍。

2)杂质C定位。量取对照溶液c 20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图至琥珀酸美托洛尔主峰保留时间的3倍。

3)降解试验。采用强酸(加6 mol·L-1盐酸0.5 mL，60℃水浴加热2 h)、强碱(加6 mol·L-1氢氧化钠0.5 mL，60℃水浴加热2 h)、强氧化(加体积分数为30%过氧化氢1.0 mL，60℃水浴加热1 h)、高温(100℃条件下加热1 h)、强光(4 500±500)lx条件下照射24 h方法对琥珀酸美托洛尔进行破坏，使其产生降解产物，同时制备空白降解溶液，按上述方法进行测定。本品在氧化降解杂质数量和杂质含量上增加明显，主峰与相邻杂质分离度分别为4.11和1.51。其他降解试验的降解产物较少，琥珀酸美托洛尔与相邻杂质的分离度均大于3。

2.4 最低检测限

取对照溶液b 20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图至琥珀酸美托洛尔主峰保留时间的3倍，量取琥珀酸美托洛尔峰高和基线噪音，计算琥珀酸美托洛尔的信噪比(S/N)为31.5。取琥珀酸美托洛尔对照溶液b用流动相稀释10倍，进样检测，记录色谱图，琥珀酸美托洛尔峰的信噪比为3.5，即最低检出浓度为0.2μg·m L-1(供试品溶液浓度的0.01%)。

2.5 精密度试验

取琥珀酸美托洛尔对照溶液b 20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图至琥珀酸美托洛尔主峰保留时间的3倍。连续进样6 次，主峰峰面积的RSD 为1.35%。

2.6 溶液稳定性

取供试品溶液和对照品溶液b，室温条件下，分别于0、4、8、12、24 h测定，杂质C、最大单杂和总杂含量的绝对偏差均不大于0.003%，说明琥珀酸美托洛尔供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 样品有关物质测定

取琥珀酸美托洛尔样品3批，按前述方法检测，计算有关物质，结果见表1。

表1 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 方法的确定

琥珀酸美托洛尔在美国药典(USP34)中列出有琥珀酸美托洛尔杂质A、B、C、D 四种杂质，英国药典(BP2011)中则列出有12种已知杂质；USP 采用分别用杂质对照品测定琥珀酸美托洛尔中杂质A、B、C、D 的含量，对4种已知杂质测定结果准确，而其他杂质仍需用自身对照法测定。EP 采用自身对照法结合杂质A 和杂质C定位，加校正因子方法计算杂质C，不加校正因子计算杂质A 和其他杂质，对杂质对照品要求相对较低。我们参照EP，经方法学验证，该方法简便、准确、可靠，能满足琥珀酸美托洛尔有关物质的限度检测要求。

3.2 耐用性

将柱温分别设定为20、25、30℃，其他按照前述色谱条件进行测定，琥珀酸美托洛尔和杂质A 的分离度无显著差异，单杂和总杂的含量测定结果无显著变化。将流动相流速分别设定为0.9、1.0、1.1m L·min-1，其他按照前述色谱条件进行测定。琥珀酸美托洛尔和杂质A 的分离度均大于8，单杂和总杂的含量测定结果无显著变化。配制流动相比例分别814∶156、824∶146、834∶136，其他按前述色谱条件进行测定，琥珀酸美托洛尔和杂质A 的分离度分别为7.9、8.8、9.1，单杂和总杂的含量测定结果无显著变化。说明该方法耐用，色谱条件的轻微改变不影响该分析方法的测定结果。