孤立性肺结节无创诊断的相关研究进展

王春秀，徐丽新，王爽，李彩红，石浩田，黄艳

(华北理工大学附属医院呼吸内科,河北 唐山)

0 引言

孤立性肺结节（solitary pulmonary nodule, SPN）定义为直径最大为3cm 且被充气肺完全包围的单一的界限清楚的放射学不透明性的病灶，临床表现常见胸水、病灶部肺不张以及肺门异常增大等[1]。孤立性肺结节性质被分为两种，一是癌性，即恶性；二是非癌性，即良性。其中约90% 以上的直径小于2cm 的SPN为非癌性的[2]。常见的恶性病变为鳞癌、肺腺癌、单发恶性肿瘤转移灶等。在全球范围内，肺癌是癌症发病率和死亡率最高的疾病，2018 年全世界有210 万新增和180 万死亡肺癌病例，约占恶性肿瘤死亡人数的1/5( 18. 4%)[3]。在我国，肺癌的发病率与死亡率也居于首位，于2017 年我国国家癌症中心公布最新的数据显示，无论大中小城市，肺癌发病率与死亡率处于全国排名第一[4]。恶性SPN 是肺癌早期表现，随着人们健康意识的提高、科技的发展，低剂量螺旋CT 应用于检查的普遍性，很大程度上提高了0.2% 至50% 左右的SPN 检出率[5]。研究证实进行肺部结节早期良恶性的筛查及制定相应的治疗方案，可降低大概20% 的肺癌死亡率[6]。因此，对恶性SPN 精准的评价十分重要。

1 胸部CT

胸部CT 是SPN 良恶性鉴别诊断有价值的无创性检查之一[7]。是重新评估胸部X 线检查可见的肺结节并持续监测结节大小变化的影像学检查手段，恶性SPN 的CT 影像特征通常包括：不规则或尖刻的边界可伴有分叶及毛刺、一般为非钙化或偏心钙化（在类癌、骨恶性肿瘤肺转移等约2%-13%的恶性SPN 中有钙化情况）、密度呈磨砂样（不均匀）、直径最大1cm 以上、位于肺上叶、胸膜凹陷和血管集束征等[8]。SPN 大小是鉴别良恶性的关键，可为独立危险因素[9]。恶性SPN没有明确特异性的影像特征，因而需通过SPN 大小，边界，密度，钙化和生长等特征预测恶性肿瘤。

2 增强 CT

快速的静脉注射 ( 浓度：300mg/m L；速度：2mL/sec) 碘化造影剂，结节强化后小于15HU 高度提示良性可能性大；强化超过20HU，则反映结节含新生血管，提示恶性可能。增强CT 局限于易将炎性病变误诊为恶性，也易发生小结节测量误差等。有研究[10]指出恶性SPN 可被动态增强CT 检出的敏感性大于95%。

3 MRI

MRI 对异常组织的分辨力高，对软组织以及血管显影的清晰度高，对其内部血液流动敏感[11]。MRI 增强对恶性SPN 的诊断有一定的帮助，但因心跳呼吸等运动伪影等影响，临床上很少应用MRI 诊断肺部结节性质。

4 PET-CT

PET-CT 可检测肺部结节的代谢状态。由于肿瘤细胞代谢活跃，摄取显像剂能力较正常细胞显著，因此在恶性病变细胞早期尚未产生解剖结构变化前，即能发现隐匿的微小病灶(大于5mm)。PET-CT 的敏感性、特异性和准确性较CT 更高[12]。其敏感性及特异性根据SPN 结节性质的不同而改变。研究报道指出虽然PET-CT 在病灶有炎症反应时可能出现假阳性的结果，对早期腺细胞癌诊断亦可能出现假阴性结果，但其对于直径大于8mm 的实质恶性SPN 的诊断价值很高[13]。

5 痰液细胞学检测

根据痰液病理中脱落癌细胞对SPN 性质作出诊断。因阳性率低，假阴性率高是痰涂片检查的弊端，临床上很少能通过痰细胞学检查对早期恶性SPN 进行诊断。随着科技不断发展，DNA 痰液检测技术提高了恶性SPN 的诊断的阳性率。

6 传统肿瘤标志物

肿瘤标志物在SPN 中较正常组织可出现异常高值[14]。目前常见肿瘤标志物包括癌胚抗原( carcinoembryonic antigen，CEA)、胃泌素释放肽前体( progastrin releasing peptide，Pro-GRP)、神 经 特 异 性 烯醇 化 酶 ( neurone specific enolase，NSE)、细 胞 角 蛋白19 片段抗原21- 1( cytokeratin 19 fragment 21-1，CYFRA21- 1)、糖 类 抗 原 ( carbohydrate antigen，CA) 125、鳞状细胞癌抗原( squamous cell carcinoma antigen，SCC- Ag)、铁蛋白等。有研究指出，CEA 有必要与其他肿瘤标志物联合检测提高诊断的敏感性，原因是其单独检测对肺结节性质诊断的特异性较高，敏感性较低[15]；NSE 常用于小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）的诊断及相关治疗效果监测[16]；Pro-GRP 是SCLC 首选的肿瘤标志物，对SCLC 诊断的敏感性和特异性较NSE 更高[17]，因此Pro-GRP 和NSE可以联合应用于SCLC 的早期诊断；血清CYFRA21-1在肺鳞癌中与其他类型肺癌相比水平明显升高[18]，Qu 等[19]的一项回顾性研究发现，恶性与非恶性SPN中血清CYFRA21-1 存在显著差异，因此可用于肺结节性质的诊断[20]；恶性肺结节患者血清SCC- Ag 水平较良性肺结节患者明显升0 高，若联合监测血清SCC- Ag、CEA、 NSE 和 CYFAR21- 1 等 水 平，诊 断的敏感性和特异性更高[21]，目前尚无研究证据显示单独应用血清SCC- Ag 水平升高用于肺结节诊断的特异性；贾国华等[22]研究指出，CA125 单独用于诊断肺癌的灵敏度（17.11%），特异度（97.56%）；CA125、CEA、NSE 和 CYFRA21- 1 联合检测恶性肺结节的灵敏度为72.37%、特异度 73.17% 、准确度为72.65%；Sukiennicki[23]等针对肺癌患者和正常人群的血清铁蛋白水平的对照研究显示，肺癌患者血清铁蛋白水平显著高于正常人群; 且血清铁蛋白水平与肺癌的发生密切相关，在恶性病变患者血清铁蛋白水平较正常人群及良性病变患者均有升高，可作为临床评估恶性肺结节性质的潜在标志物[24]。因肿瘤标志物表达受多种因素影响，故多种肿瘤标志物联合检测的方法对恶性SPN 的诊断仍存在很大的不稳定性，仍然需要继续寻找更为高效、稳定判断出恶性SPN 的无创方法。

7 免疫学标志物

肿瘤特定抗原或肿瘤相关抗原( tumorassociatedantigens，TAAs)。TAAs 自身抗体可在恶性肺结节早期阶段检测出，TAAs 自身抗体较TAAs 在血清中可稳定、高水平的长时间存在，因此TAAs 自身抗体可以用来诊断评估恶性肺结节[25]。特定的TAAs 自身抗体常常出现在无症状病变早期，可在CT 检查结果无法评估诊断之前出现异常值。国外当前应用于临床的TAAS 自身抗体谱包括p53、性别决定基因家族2、蛋白基因产物9.5、黑色素瘤抗原A1、CAGE、GBU4-5G、抗原 - 7 抗体等 7 种，Jett 等[26]研究显发现，基于以上自身抗体诊断肺癌的特异度可达91%，灵敏度可达37%，阳性预测值可达16%。Massion 等[27]研究显示，以上7 种肿瘤自身抗体谱对直径在4～20mm 肺结节性质检测的准确性有显著的升高。Sullivan 等[28]研究指出，TAAs 自身抗体对肺癌和早期恶性肺结节的诊断具有较高价值。一项对中国人群的临床研究表明，应用以上7 种TAAs 自身抗体对肺结节性质诊断的灵敏度和特异度分别为61%和90%[29]。多个研究表明，以上免疫标志物可与CT 联合应用提高对肺结节性质评估的准确性，但以上TAAs 自身抗体无特异性，在其他肿瘤以及其相关免疫性疾病中亦可升高，仍存在一定的局限性，此外，由于肺癌质性的差异，单一的TAAs 自身抗体对于检测肺癌类型还存在不足。

8 RNA 相关标志物

微RNA( microRNA，miRNA) 是真核生物调控非编码基因的RNA，miRNA 通过调控原癌和抑癌基因的表达作用，导致恶性肿瘤相关miRNA 水平改变。有研究发现，恶性较良性肺结节患者血清中miR-21-5p 和miR-574-5p 呈高水平表达[20]，Shen 等[30]研究指出，孤立性肺结节组miR-21 和miR-210 水平明显升高，而恶性肺结节组较健康组及良性肺结节组miR-486-5p 呈低水平表达，因此，肺结节恶变相关的血miRNA水平对早期恶性肺结节的诊断有一定的指导价值。

9 DNA 甲基化

DNA 甲基化是基因转录和基因组稳定性的关键调节剂。DNA 甲基化水平的改变经常在人类肿瘤中发现，包括肺癌[31-32]。早于2005 年，德国海涅大学的Schmiemann V 等提出了检测基因甲基化异常状态诊断早期恶性肺部病变[33]。明显的肺癌恶性表型较DNA 甲基化相对滞后[34]，基因甲基化一般发生在癌前病变和癌变早期，因此DNA 甲基化可以作为肿瘤早期及恶性SPN 诊断的理想标志物。在肿瘤的发生发展过程中，肿瘤细胞释放DNA 进入血液，在体液中可以检测出某些基因的甲基化，因此DNA 甲基化可应用外周血取样[35]。有研究指出，病变组织及外周血样本中的某种DNA 甲基化检测结果水平大致相同[36]。因此非常适合无创检测恶性病变的早期诊断。多种DNA甲基化可以用作肺癌早期诊断的有前途的生物标记，例 如 p16，RASSF1A，APC，DAPK，RARβ ，CDH13，RUNX3，SHOX2 和 PTGER4 等。

p16 基因，是细胞周期蛋白依赖性激酶4 的抑制剂，细胞中p16 纯合子基因异常状态致使细胞增殖异常，引起恶性病变。研究表明，吸烟者中该基因甲基化存在增高趋势，与良性肺部病变患者相比恶性患者中p16 基因甲基化呈高水平表达，肺腺癌相比肺鳞癌患者中p16 启动子甲基化率明显增高。在这个研究中显示p16 基因甲基化参与了肺癌的发病机制，并且是恶性SPN 病变的危险因素[37]。

RASSF1A 是Ras 家族的基因之一，与人类肿瘤中Ras 信号转导途径的激活有关，是重要的抑癌基因，调控细胞周期，抑制肿瘤的发生和发展[38]。RASSF1A 基因启动子区域的高度甲基化可以下调该基因，使RASSF1A 失去抑癌功能，从而可诱发恶性病变。RASSF1A 在癌症早期进展中就开始发挥作用。RASSF1A 的异常甲基化已在肺癌中报道[39-40]。

抑癌基因APC，该基因启动子区过度甲基化导致抑癌基因表达的异常，以至于细胞恶性增殖及分化，甚至细胞无法正常凋亡，导致细胞癌变。Feng 等[41]研究显示，APC 基因在肺癌中的甲基化率为22.0%，Huang等[42]对151 项研究进行的荟萃分析示恶性肺部结节患者血清中该抑癌基因甲基化率较良性肺部疾病患者显著增高。

死亡相关蛋白激酶（death associated protein, DAPK）[43]是一类多基序钙调控的丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶。DAPK 可以正调控细胞凋亡，参与细胞自噬等生理过程。DAPK 的功能障碍及失活可使细胞异常增殖，导致细胞恶性病变。DAPK 基因的启动子基因的甲基化水平程度根据恶性肿瘤细胞的而不同而改变。

维甲酸受体β（Retinoic acid receptor-beta，RARβ）基因位于3p24 号染色体，这是肺癌中经常缺失的区域，诱导其表达可以抑制癌变。曾有研究报道，在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）组织中经常观察到RARβ 甲基化程度高，Song X[44]等报道，与非恶性肺组织相比，NSCLC 中RARβ 启动子的高度甲基化显着增加，并且在非典型类癌（atypical carcinoid，AC）中占主导地位，这表明RARβ 甲基化有助于NSCLC（特别是AC）的发展。

T- 钙黏蛋白( T-Cadherin/H-Cadherin, CDH13)是一种新型钙黏蛋白分子。有研究指出，很多不同恶性肿瘤细胞中CDH13 CPG 岛的甲基化以及CDH13 基因表达沉默，而正常组织中CDH13mRNA 表达显著增高，提示其表达减少或缺失可能与癌变有关。多项研究表明，CDH13 的再表达可抑制肿瘤的生长和侵袭[45]。通常CDH13 启动子的甲基化常发生在癌症病变的早期。相比肺鳞状细胞癌，肺腺癌其甲基化率明显增高[42]。

RUNX3 位于人类染色体1p36 上，该区域长期以来被认为是各种肿瘤中的抑癌基因。RUNX3 主要表达沉默和失活。在各种肿瘤相关文献中报道了由于DNA 高甲基化导致RUNX3 失活，促进肿瘤细胞发展。包括肺癌等[46]。RUNX3 在肺癌中更频繁地甲基化，并且RUNX3 甲基化发生在早期。

矮小同源盒2（short stature Homeobox 2，SHOX2）基因是抑癌基因，主要作用是修复DNA；SHOX2 高度异常甲基化使其抑癌功能沉默导致癌变[47-48]。2010 年，Schmidt 等[49]首次发现SHOX2 甲基化对鉴别肺部良恶性病变有这一定价值。在恶性肺结节组织，结节周围淋巴结、支气管灌洗液，胸腔积液及血浆中均检测到SHOX2 甲基化呈高表达[50-53]。

前列腺素E 受体4( PTGER4)，该基因缺失、沉默和失活可抑制非小细胞肺癌的生长，其过度表达与非小细胞肺癌的生长和侵袭有关[54]，联合SHOX2 基因检测可提高恶性肺部病变的检出率[55]。PTGER4 是前列腺素E2（PGE2）配体之一，前列腺素E2 是环氧合酶-2(Cyclooxygenase- 2，COX- 2)的生物活性产物，PGE2 可通过与PTGER4 配体结合来发挥生理功能，参与细胞增殖、组织侵袭、血管生成及凋亡等多种过程[56-57]，在许多实验系统中指出COX-2 和PTGER4 在多种癌前病变和肿瘤组织中过度表达[55,58]，可导致预后不良[59]。PTGER4 的激活增加癌细胞侵袭能力[60]。

Weiss 等[55,61]发现 SHOX2 联 合 PTGER4 基 因甲基化的检测对鉴别SPN 良恶性有显著作用。其曲线下面积（AUC）为0.88。灵敏度为90% 时，特异度为73%，特异度为90%时，灵敏度为67%，显著优于传统肿瘤标志物检测。以上实验研究表明，对联合DNA 甲基化水平检测结果分析，有较高的特异性，对恶性SPN的临床诊断提供了可避免有创操作的检验方法。有相关研究表明，恶性肺部结节发生的不同时期伴随着不同抑癌基因的甲基化[62]，故仅凭一种基因甲基化检测结果对SPN 性质进行诊断尚不准确。随着基因甲基化检测技术的成熟，使甲基化检测更稳定和更便宜，可以完善更多基因的甲基化检测。综上所述，DNA 甲基化可以作为有效诊断恶性肺部病变的新型标志物。

10 其他

分泌型磷脂酶A2-Ⅱa，肝细胞生长因子，血清蛋白质组生物学标志物片段，循环肿瘤细胞，p53 抗体[63-64]等均对恶性肺结节性质的评估有一定价值，但其预测肺结节良恶性的敏感性以及特异性较差，尚缺乏更多临床的有效验证。

11 总结及展望

恶性SPN 患者预后好与差，决定于早期对恶性SPN 的精确诊断。虽然外周血多基因甲基化联合检测在恶性SPN 无创诊断中的地位呈上升趋势，但因各级医院医疗条件有限，可进行该检验的患者仍处于少数范围，基因甲基化缺乏实用性，以及对于非恶性SPN 患者基因异常甲基化的预后和通过手术切除恶性病灶后基因甲基化有无改变等的问题，仍然需要长期随访。随着中国政治经济的不断发展，人们对健康的认识越来越全面，这种观念不仅存在经济富裕群众中，而是面向全社会的人民群众，大多因影像检查发现较小SPN的患者是否进一步检查（基因甲基化等），取决于就诊当地医院的医疗条件以及检测价位。可进一步建立包含临床体征、外周血DNA 甲基化、影像学特征等对体积较小的SPN 良恶性评估更为精准的预测模型，进而对恶性SPN 进行预测，根据预测结果，选择是随访观察还是尽早手术切除等最佳的干预措施，尽量避免盲目有创手术及病理活检等过度医疗，把握治疗最佳时期。