植物外泌体提取及应用研究进展

帖慧琳，李春磊，王浩然，于荣敏，朱建华

（暨南大学 药学院，广东 广州 510632）

真核细胞释放到细胞外空间的小泡称为胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）[1]。 EV在细胞间[2]和种间通讯[3]及免疫反应[4]中起重要作用[5]。到目前为止，已经在真核细胞中发现了3种EV，包括多囊体（multivesicular body，MVB）-质膜（plasma membrane，PM）融合产生的外泌体，从PM直接萌发的微囊泡，以及细胞死亡过程中产生的凋亡小体[6-8]。

外泌体是真核细胞分泌的直径为40～100 nm的细胞外囊泡，是细胞内MVB与PM融合后从细胞中释放的小泡[9]。许多哺乳动物细胞有释放外泌体的能力，包括网织红细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、肥大细胞、上皮细胞、肿瘤细胞等。在动物细胞中发现外泌体后，越来越多的证据表明在植物中会出现MVB和类似外泌体的囊泡。这些发现主要集中在细胞生长和分化（包括与细胞壁相关的过程）研究上，或集中在植物对各种胁迫的反应上[10]。

除了动物体液外，许多植物中也发现含蛋白质和小RNA的外泌体样纳米粒子，如生姜、胡萝卜、西瓜葡萄、橄榄、瓜子。这些植物外泌体由于缺乏毒性，有大规模生产的可能性，其内在特性和携带药物或小RNA分子等其他化合物的可能性，在医疗应用中引起了广泛关注[11]。Regente等[12]于2009年首次发现植物中存在外泌体样小泡，该小泡在向日葵种子中直径为50～200 nm。其后许多研究集中于囊泡及其生物活性成分的深层表征，以更好地了解其内在特性和可能的生物技术应用。有研究通过超速离心从植物物种，如葡萄、葡萄柚、姜和西兰花中分离出带有特定的蛋白质组、脂质组和转录组谱的细胞外囊泡[13-16]；并发现这些可食用植物来源的囊泡有抗炎特性：葡萄、葡萄柚来源的外泌体样纳米颗粒有靶向肠道细胞的作用，并能在使小鼠免受硫酸葡聚糖钠诱导的结肠炎方面发挥作用[13-14]。

1 植物外泌体分泌方式和物质构成

植物外泌体与动物外泌体形态结构类似，有磷脂双分子层结构，含有蛋白质和微小RNA，呈茶托状或杯状，其形态可利用透射电子显微镜（TEM）观察[17]。提取外泌体总脂后，对其进行更详细分析[18-19]。蛋白质分析表明，包含参与信号传递的蛋白质，其中许多蛋白质在应激和免疫反应中被高度诱导；还包含涉及活性氧信号传导和氧化应激反应的蛋白质，及各种膜转运蛋白和囊泡内转运蛋白[20]。植物外泌体含有较丰富的miRNA，其为一类长度约为22个核苷酸的内源单链非编码RNA，在生物体中起重要作用，是一种高效的基因表达调控因子[21]。越来越多报告显示，miRNA不仅在其原始系统内执行生物学功能，还可进行跨界基因表达调控[22]。

2 植物外泌体的分离纯化及鉴定

2.1 植物外泌体的分离纯化

目前，外泌体的分离方法主要包括超速离心法[23]、蔗糖密度梯度离心法[24]、超滤离心法[25]、免疫磁珠法[26]、聚合物沉淀法[27]、尺寸排阻色谱法[28]和微流控技术[29]。这些分离方法均有各自的优势和局限性。超速离心法和蔗糖密度梯度离心法利用外泌体与其他组分在密度和大小上的差异，通过不同的离心力分离外泌体，操作简单、获得的外泌体数量较多，但工艺费时、回收率不稳定，反复离心可能会对外泌体造成损伤[23-24]。超滤离心法是基于粒子大小的分离技术，利用超滤膜将外泌体从蛋白质等生物大分子中分离，不影响外泌体的生物活性，但可能损伤外泌体，不能保持其形态[25]。免疫磁珠法是基于外泌体表面的受体对其进行分离，能分离所有外泌体或外泌体的选择性亚型，但这种方法成本高，使用条件苛刻，不适于大量样品，且此方法分离的囊泡可能失去原有的功能活性[26]。聚合物沉淀法利用聚合物（如聚乙二醇）劫持水分子，使外泌体溶解度下降，再通过低速离心分离，操作简单、无需专门设备，目前已实现商品化，但提取过程中脂蛋白和聚合物之间可能产生沉淀，导致外泌体纯度降低[27]。尺寸排阻色谱法是基于分离分子的大小和尺寸进行分离，分离纯度高、可保证外泌体的完整性和生物活性，但提取的外泌体浓度低，后续应用需浓缩，且需专业设备[28]。近年，新发展的微流控技术是一种基于外泌体生物化学和物理性质差异的微尺度分离技术，样品处理速度快、成本低、灵敏度高，但产量较低，仅适用于诊断[29]；还有试剂盒提取外泌体，此法操作简单便捷，不需特殊设备，随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐渐提高，但市场上各类产品分离纯化效果良莠不齐[30]。

目前，大多用超速离心法和蔗糖密度梯度离心法提取植物外泌体。Regente等[12]最早从向日葵种子中提取细胞外囊泡。将20g种子中提取的细胞外液通过0.5 μm膜过滤，并通过连续离心步骤分别按照步骤10 000g离心30 min，40 000g离心60 min和100 000g离心60 min分级分离。弃去第一个沉淀，将40 000g和100 000g沉淀部分分别重悬在Tris-HCl pH 7.5缓冲液中。结果在40 000g部分有较高密度50～200 nm 囊泡样小泡。Brian等[20]提取拟南芥叶片的细胞外囊泡，将上述方法40 000g离心部分在OptiPrep密度梯度中纯化。Wang等[14]分离柚子的细胞外囊泡，去除果皮，将果肉在高速混合器中于4 ℃下均化1 min。依次将收集的汁液以20 000g离心20 min，然后以10 000g离心1 h除去碎屑。将纳米囊泡以150 000g沉淀1.5 h，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤1次，然后使用蔗糖梯度（分别为8 %，30 %，45 %和60 %）纯化和分离。

综上，植物外泌体的提取方法一般是将待提取部位处理后，先低速离心除去杂质，再高速离心分离外泌体，然后使用密度梯度纯化。根据提取的植物种类、部位及作用目的不同在实验中对提取方法进行调整。

2.2 植物外泌体的鉴定

可使用纳米颗粒跟踪分析仪（NanoSight）平台、BCA比色法或Bio-Rad蛋白质定量测定试剂盒[17]，通过比较纳米囊泡计数与蛋白质浓度的比值估算囊泡制剂的纯度；使用电子显微镜检查，观察到外泌体的杯状圆形结构，动态光散射分析其粒径大小约为40～100 nm；流式细胞分析（FACS）进一步证实了所研究囊泡的同源性；采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术对外泌体进行广泛的蛋白质分析，将其与已知的植物外泌体蛋白质进行比对分析[31]。

目前，对植物外泌体的鉴定主要是采用电子显微镜观察形态和动态光散射分析粒径分布。动物外泌体已有标记蛋白可确定，但植物外泌体在这方面的研究还不成熟。

3 外泌体的功能及应用

3.1 对肠道菌群的作用

饮食已被证明对人肠道菌群的组成有相当大的影响[32]。Yun等[33]研究了植物来源外泌体中RNA对肠道菌群的作用，从生姜外泌体中鉴定出小RNA和miRNA，可调节肠道微生物组成及其代谢产物，并抑制小鼠结肠炎。主要机制：（1）富含脂质的ELN生姜外泌体发出一个信号，导致肠道细菌对其进行吸收；（2）外泌体的小RNA介导肠道微生物和宿主免疫系统之间的相互作用，形成免疫和肠道微生物之间的平衡；（3）外泌体RNA调节肠道微生物的组成、代谢产物、生长和定位。具体是生姜外泌体中RNA诱导的肠道益生菌LGGI3A通过激活AHR信号通路促进IL-22表达，在屏障表面诱导抗微生物免疫和组织修复。此前，其他研究也发现生姜类外泌体纳米粒子可降低炎性细胞因子[肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）和IL-1β）]表达，增加结肠炎模型中的抗炎细胞因子（IL-10和IL-22）的表达[34]。

3.2 种间通讯

Mu等[17]从葡萄、葡萄柚、生姜、胡萝卜4种食用植物中分离和鉴定了外泌体，证实了这些细胞外囊泡大小和结构与哺乳动物的外泌体相似。这些植物外泌体被肠道巨噬细胞和干细胞吸收，并对受体细胞有生物学效应。其中，生姜外泌体诱导巨噬细胞内血红素加氧酶-1（HO-1）和IL-10表达；而包括葡萄和葡萄柚在内的果源外泌体诱导Wnt/TCF4活化，Wnt信号是维持肠内稳态的关键。研究表明，植物通过类外泌体纳米颗粒，与哺乳动物细胞（特别是肠道巨噬细胞和干细胞）交流，且不同类型植物的外泌体对受体哺乳动物细胞有不同的生物学效应。

Rutter等[20]从拟南芥玫瑰花的质外体液中纯化了囊泡。这些囊泡富含与应激和防御相关的蛋白质，在感染细菌性病原体丁香假单胞菌的强毒株入侵期间和响应水杨酸（SA）的过程中，囊泡分泌增强。数据表明，外泌体有助于先天免疫，并可能介导植物和动物体内的细胞间通讯。Zhao等[35]研究椰汁miRNA和外泌体发现，椰子分离的纳米粒子粒径小于从牛奶中提取的外泌体。这些植物衍生的纳米粒子可能与动物衍生的外泌体相似，因此，植物衍生的miRNA有很大的潜力可通过外泌体被吸收到哺乳动物体内。Baldini等[36]在柑橘外泌体样纳米粒子的抗氧化研究中，根据其研究结果推测水果衍生纳米粒子在进食后有可能介导物种间的通讯。

3.3 植物防御

外泌体在病原体侵袭期间在植物细胞中增殖，且常在MVB与PM融合的各种状态下可见。大多数融合发生在乳头状结构或细胞外防御结构附近，这些结构能阻止病原体进入细胞[37-38]。促进MVB与PM融合的GTPase酶也积聚在感染部位附近，是成功形成乳头状细胞所必需的[39-40]。此外，TEM显示，乳头状基质含有MVB与PM融合后产生的外泌体[41]。Nielsen等[39]在研究白粉病真菌对拟南芥入侵的过程中也发现了多囊泡聚集，病原体入侵会导致植物细胞多囊泡与质膜融合分泌外泌体。这些数据表明植物中外泌体的分泌有助于对病原体的早期防御结构发展。

外来体也可介导小干扰RNA从植物细胞到真菌细胞的运输。在宿主诱导的基因沉默过程中，在植物（特别是厚朴）中表达的小RNA能减少入侵真菌中目标转录物的表达[42]。

3.4 储存和运输

采摘被子植物和裸子植物，如桦树、云杉和杨树的茎和枝条，液氮低温机械破坏，对样本进行扫描电子、原子力显微镜、内切葡聚糖酶活性测定等。研究表明，被子植物和裸子植物次生韧皮部和次生木质部的外泌体在内源葡聚糖酶的储存和运输中有生理作用[43]。

3.5 药物载体

外泌体相比较传统纳米载体系统，生物相容性好、利用度高且安全无毒，并能成功携带模型药物和目的基因进一步应用于各种疾病的药物递送系统研究[30]。目前动物外泌体装载化学药物、核酸药物及植物提取物的研究已有报道。外泌体有强大的穿透能力，可穿透体内屏障，在体内的稳定性较好，具有脂质双分子层膜结构，能包裹疏水性药物，将药物运送到达受体细胞。有研究表明，由于外泌体体积较小，能避免被单核吞噬细胞系统清除，延长药物在体内的半衰期[44]。

研究表明[45]通过植物外泌体可将疏水性的姜黄素传递到结肠肿瘤和正常结肠组织中，外泌体可被作为细胞处理致癌miRNA的载体。Wang等将葡萄柚产生的细胞外纳米囊泡装载甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）递送给小鼠，能显著降低MTX毒性，并提高其在硫酸葡聚糖钠诱导的小鼠结肠炎中的治疗作用[14]。

3.6 治疗炎症性肠病

Wang等[14]证明了葡萄柚衍生的纳米囊泡被肠道巨噬细胞选择性吸收，并改善了葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎。这些作用是通过上调血红素加氧酶-1（HO-1）的表达并抑制肠道巨噬细胞中IL-1β和TNF-α的产生而介导的。

一些研究表明，含有姜黄素的外泌体对乳腺癌和大肠癌等多种癌细胞有治疗作用[46]。包裹姜黄素的葡萄柚外泌体可改善结肠炎，增加小鼠存活率，减少粪便中的血液，减少体重下降，减少结肠组织中白细胞的浸润。免疫酶联分析（ELISA）表明，包裹姜黄素的葡萄柚外泌体对葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠结肠组织提取液中TNF-α、IL-6和IL-1b的降低与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。这种治疗策略可用于治疗多种炎症性疾病，包括癌症和自身免疫性疾病[47]。这些发现表明，外泌体可在肠道中充当免疫调节剂，维持肠道巨噬细胞稳态，并可用于开发口服小分子药物，减轻疾病中的炎症反应。

3.7 在癌症中的作用

Raimondo等[48]研究表明，柑橘柠檬汁中外泌体能通过诱导TRAIL（肿瘤坏死因子α相关凋亡诱导配体）介导的细胞死亡抑制肿瘤细胞生长，而不影响正常细胞，表明食用植物纳米小体可能是一种可行的肿瘤治疗方法。

4 结论与展望

近年，外泌体已成为生物学、医药学等领域的研究热点，尤其是可食用植物外泌体的研究在不断增加。目前，外泌体的研究大多集中在动物细胞外泌体，如来源于肿瘤相关巨噬细胞的细胞外泌体，其含有缺氧诱导因子1α（HIF-1α）稳定性lncRNA，可调控乳腺癌的有氧糖酵解[49]；来源于横纹肌肉瘤的细胞外泌体，对受体横纹肌肉瘤细胞和成纤维细胞的增殖有积极作用[50]；各种研究均致力于寻找更好的治疗策略以解决各种困扰人类已久的肿瘤、癌症等疑难杂症，也确实取得了可观效果。

然而，对植物外泌体的研究还较少。在植物外泌体研究中存在的主要问题有：第一，植物外泌体提取方法较单一，提取工艺优化研究也较少；第二，动物外泌体可通过标记蛋白进行鉴定，但植物外泌体的鉴定中最常用的仍是电镜观察和粒径分析；第三，植物外泌体的研究对象更多是类外泌体纳米颗粒，并不完全是外泌体，其范围较广泛，如果能进一步优化提取工艺和鉴定方法，植物外泌体的研究会更有说服力。已有的研究表明，植物外泌体在植物防御免疫、种间通讯、治疗哺乳动物炎症反应、作为药物载体等方面均表现出一定的作用，也表明在这些方面，植物外泌体的发展前景十分广阔。