基于HPLC-MS测定泪液中小分子化学成分的研究进展

仲 洁，于艳梅

（1. 禹城市人民医院眼科，山东 禹城 251200；2. 济南市食品药品检验检测中心，山东 济南 250102）

泪液是一种可通过简单非侵入性方式收集的生物液体。与汗液或唾液相比，泪液不易受到环境污染。泪液能润滑角膜上皮细胞和组织，并反映人体生理状态。由于泪液体积小、样品浓度低，泪液小分子化学成分的测定研究对分析仪器检测水平提出了较大挑战[1-8]。高效液相色谱-质谱法联用（HPLC-MS）有高灵敏度、高通量、高精确度和应用范围广等优势，已广泛用于动物、植物等微量样品的分析和鉴定工作[9-14]。

与血液样品相比，泪液采集创伤小，样品复杂程度低。泪液作为血浆样品的替代物可用于检测治疗药物浓度。近年，基于HPLC-MS测定眼科局部给药、口服给药和胃部注射给药后泪液中外源性药物浓度的研究工作已有报道[15-23]。然而，相比血液样品，研究者对泪液中外源性药物的定量分析研究相对较少。另外，机体的生理状态与泪液内源性小分子化学成分的组成有相关性[3]。目前，泪液中类固醇、脂质及多肽等内源性小分子化学成分的测定也仅有少量报道[24-30]。

1 外源性药物的检测

1.1 眼科局部给药

眼科局部给药是治疗眼科疾病常用的给药方式。贝西沙星（besifloxacin）是治疗细菌性结膜炎的第四代广谱氟喹诺酮类药物。Su等[15]以Sepax GP苯基柱为分离柱，建立了基于HPLC-MS/MS快速、灵敏和高选择性地定量测定兔血浆、泪液、房水、结膜和角膜中besifloxacin的新方法。采用电喷雾离子（ESI）源和多反应监测（MRM）的正离子模式，以那格列奈（nateglinide）为内标物，建立besifloxacin的分析方法。其中besifloxacin的监测跃迁为394.2→377.1，内标物的监测跃迁为318.3→166.1。血浆样品中besifloxacin在0.103～206 ng/ml范围内呈良好线性关系，泪液、房水、结膜和角膜样品中besifloxacin在2.06～2060 ng/ml范围内呈良好线性关系。该方法成功地应用于单次及多次局部给药后兔血浆及眼组织中besifloxacin的药动学研究。

由于环孢菌素A（cyclosporine A）水溶性低，其眼科给药剂型受到较多关注。一种新型的水溶性cyclosporine A前药用于治疗干眼疾病[16]。研究表明，此前药制剂有良好的眼耐受性，对基础泪液产生无影响，并维持眼表特性不变。为了研究水溶性cyclosporine A 前药和cyclosporine A水包油乳剂的药动学差异，建立了一种基于超高压液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）测定cyclosporine A含量的方法，证明水溶性cyclosporine A 前药和cyclosporine A水包油乳剂在15 min至48 h之间具有相似的药动学过程。Cyclosporine A前药能渗透到眼内其他组织，在眼前段和后段的组织中均达到治疗浓度水平，且cyclosporine A前药比乳剂具有更高的生物利用度和更低的消除率。

第二代氟喹诺酮衍生物氧氟沙星（ofloxacin）是目前治疗和预防动物和人类眼表感染最常用的药物之一。眼科药物缓释系统能提高眼科疾病治疗疗效，同时减少副作用和用药频率。为了比较新型眼科ofloxacin缓释装置与传统ofloxacin滴眼液给药方式的差异，首次建立了一种HPLC-ESI-MS/MS法测定兔眼泪中ofloxacin含量的方法[17]。该方法结果可靠、重现性好，已经成功应用于ofloxacin新型聚合物植入式装置与常规眼用制剂的药动学比较研究。与传统ofloxacin滴眼剂相比，新型装置可调节ofloxacin的释放速度，提高其在眼内的生物利用度。为了增加氯替泼诺（loteprednol etabonate）在眼表的滞留量，改善眼内组织的药物输送，Glogowski等[18]研制了一种治疗眼部炎症的新型凝胶制剂。结果表明，这种凝胶制剂能延长兔眼表面loteprednol etabonate的滞留时间，并能将该药物输送至眼前段组织如兔结膜、角膜和虹膜睫状体等。人和兔眼泪液中loteprednol etabonate在24 h内均维持在可测量水平。

Besifloxacin、cyclosporine A、ofloxacin和loteprednol etabonate 4种药物均采用反相LC-MS/MS进行定量分析研究。对于含有极性功能基如多羟基、氨基或羧基的待检测药物，这些成分可能在反相色谱保留较弱，因此可选择一些极性色谱固定相开展泪液样品的分析研究。纳他霉素（natamycin）是一种多羟基的大环内酯类化合物。Bhatta等[19]以氰基柱（100 mm×2 mm，3 μm）为色谱分离柱，首次建立了一种基于HPLC-MS/MS高选择性和高灵敏度地测定兔眼泪液中natamycin含量的方法。采用ESI源和MRM的负离子模式，以两性霉素B （amphotericin B）为内标物，建立natamycin的分析方法。Natamycin在25～800 ng/ml浓度范围内呈良好线性关系，检测限为12.5 ng/ml。本方法成功地用于natamycin滴眼液在新西兰兔眼泪液的药动学研究。奥洛他定（olopatadine）是一种含有羧基和叔胺片段的小分子药物。Maksić 等[20]以酰胺柱（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm）为色谱固定相发展了一种亲水作用液相色谱（HILIC）-MS/MS法测定人泪液中olopatadine含量的方法。该方法有灵敏度高、选择性好、样品制备简单和色谱运行时间短等优点，可用于人泪液中olopatadine的药动学评价。

1.2 口服给药

口服给药是疾病治疗中常用的给药方式，有给药方式简便、不直接损伤皮肤或黏膜的优点。部分研究发展了口服给药后泪液中小分子药物成分的分析方法。Hirosawa等[21]利用超高速LC-MS/MS快速、高灵敏地测定了人泪液和血浆中的非甾体抗炎药物布洛芬（ibuprofen）和洛索洛芬（loxoprofen）的浓度。这是在泪液中检测非甾体抗炎药物的首次报道。两种药物在泪液和血浆中的回收率分别为96.0 %～117.0 %和99.0 %～105.7 %，并在0.02～1.0 μg/ml（泪液）和0.1～5.0 μg/ml（血浆）的浓度范围内呈良好线性关系。该检测方法仅需10 μl泪液和20 μl血浆即可完成定量分析，因此在临床和毒理学分析中具有较好应用前景。

Sebbag等[22]采用HPLC-MS/MS法测定了泪液中强力霉素（doxycycline）的含量，并比较了口服给药后Schirmer试纸和聚乙烯醇缩醛海绵两种收集装置采集的泪液中定量分析doxycycline的精密度。结果表明，doxycycline在猫泪液中浓度达45.1～900.7 ng/ml，犬泪液中浓度达45.4～632.0 ng/ml。与聚乙烯醇缩醛海绵相比，Schirmer试纸收集泪液方式有更高精密度。因此，Schirmer试纸是定量分析泪液中doxycycline的良好选择。

1.3 注射给药

Shiokawa等[23]首次报道了基于氨基键合固定相的HILIC-MS/MS高通量定量分析人眼泪和血浆中替加氟（tegafur）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil）的新方法。他们采用大气压化学电离和MRM监测的负离子模式，以5-chlorouracil为内标物，建立tegafur和5-fluorouracil的分析方法。泪液和血浆样品中药物在0.04～4.0 μg/ml浓度范围内呈良好线性关系。本方法成功地用于临床样品中tegafur和5-fluorouracil的高通量分析。

2 内源性小分子化学成分的检测

2.1 类固醇类

干眼症是一种多因素眼表疾病，有研究表明类固醇类组分对眼表有保护作用。为了探讨干眼症与泪液中类固醇水平的关系，Pieragostino等[24]建立了一种稳定、特异、选择性地同时定量分析泪液中皮质醇（cortisol）、皮质酮（corticosterone）、11-脱氧皮质醇（11-deoxycortisol）、4-雄烯酮-3, 17-二酮（4-androstene-3, 17-dione）、睾丸激素（testosterone）、17α-羟孕酮（17α-hydroxyprogesterone）和黄体酮（progesterone）的方法。结果表明，干眼病患者中cortisol、11-deoxycortisol、4-androstene-3, 17-dione和17α-hydroxyprogesterone的含量明显低于对照组。经统计分析，表明此法对干眼病有良好的预测能力。因此，泪液可用于研究眼部的病理生理状态。

Gibson等[25]开发了一种UPLC-高分辨率（HR）-MS技术同时测定14种性类固醇标准品的方法。此法测定人泪液中progesterone、androsterone glucuronide（雄甾酮葡萄糖醛酸）和5α-雄甾烷-3α,17β-二醇（5α-androstane-3α,17β-diol）的含量。由于泪液体积小且性类固醇浓度低，因而需混合泪液样品才能获得足够的样品量进行分析。

2.2 脂质类

Schnur等[26]采用薄层色谱法、酶法和质谱法对泪液中脂质成分进行分析和鉴定。根据酶分析，含胆碱的脂类、甘油三酯和胆固醇酯的浓度分别为48±14，10±0和21±18 μmol/L。UPLC-飞行时间（TOF）-MS分析表明，极性脂类磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺占所有鉴定脂类的88 %±6 %。从生理学角度分析这些脂质成分，揭示了泪液中脂质的功能作用，为眼表疾病的治疗提供了新途径。Dean等[27]采用HPLC-MS鉴定了刺激性人眼泪中的磷酸胆碱脂质化合物，并证明了泪液中高质量数、完整的磷脂酰胆碱为泪液脂质蛋白的天然配体。

2.3 多肽和氨基酸类

内源性肽是生物学过程分析的重要指标。泪膜含有泪腺/黏膜细胞释放的蛋白质和多肽，包括参与抵抗外源性病原体的抗微生物肽。但是，鉴定泪液中多肽含量的报道较少。Elortza等[28]采用不同的裂解方法碰撞诱导裂解（CID）、电子转移离解（ETD）和高能诱导裂解（HCD）分别从泪液中鉴定了157，131和122个肽，共鉴定234个不同的肽，是迄今为止最大的泪液内源性多肽数据集。此法有望应用于不同的生物体液中，以鉴定和发现具有其他生物学功能的多肽，如细胞保护、抗炎或伤口愈合等，从而拓宽此法的应用范围。

Nakatsukasa等[29]采用HPLC-ESI-MS/MS分析了人泪液中23种氨基酸组成。结果表明，氨基酸组成聚类分析能明确区分严重眼表疾病和非眼表疾病。与非眼表疾病组相比，严重眼表疾病组牛磺酸、L-蛋氨酸和精氨酸的相对含量较低，表明眼表疾病状况可能与氨基酸变化有密切关系。

2.4 维生素类

Khaksari等[30]采用HPLC-MS法测定婴儿及母亲泪液及血清中水溶性和脂溶性维生素的水平。样本来自于15个家庭，每对包括1个4个月大的婴儿和1位哺乳期母亲，比较每个受试者的眼泪和血清之间及婴儿和母亲之间的维生素浓度差异。结果表明，水溶性的维生素B1，B2，B3（nicotinamide），B5，B9和脂溶性维生素E（α-tocopherol）在泪液和血清中均能检测到，然而脂溶性维生素A（retinol）仅在血清中检测到。该工作首次实现了维生素 A、B和E的同时检测，并明确了泪液和血清中维生素浓度之间的相关性。因而，泪液能充分反映血清中维生素水平，加快维生素缺乏症的诊断速度。

3 泪液样品制备

泪液是唯一可轻易获得的非侵入性的样品基质。泪液可通过Schirmer试纸[15,17,18,20,22,24-25,30]、聚乙烯醇缩醛海绵[22]和刻度毛细管[16,19,21,23,26-29]（玻璃或塑料）等方式收集。Raju等[31]概述了常见的泪液收集技术，强调标准化的取样时间和体积对获得重复性结果非常重要。由于操作简单，较多研究工作采用 Schirmer试纸收集泪液，个别采用聚乙烯醇缩醛海绵收集。收集泪液后，常采用高速离心或者甲醇洗脱。Schirmer试纸和聚乙烯醇缩醛海绵收集泪液的缺点是渗透到试纸/海绵上的泪液体积很难准确测定，小分子化学成分的回收率也无法保证。采用玻璃或塑料毛细管直接取样可提供准确的小体积样品，采用小体积流动相稀释并离心后，上清直接质谱进样或经固相萃取步骤再进行HPLC-LC分析。毛细管直接取样避免了从支撑材料中不完全萃取分析物的潜在风险。不论是采用Schirmer试纸/聚乙烯醇缩醛海绵取样，还是采用毛细管取样均应避免刺激眼睛，防止泪液的过多分泌而稀释泪液中小分子化学成分的浓度。

4 展望

泪液体积小、浓度低，是测定泪液小分子化学成分过程中的难点，极大地限制着泪液在药物浓度监测和代谢组学方面的研究工作。另外，即便采用毛细管能准确测定泪液体积，然而在质谱分析前，仍不可避免地稀释泪液样品，引起小分子化学成分浓度下降。发展泪液样品在线预处理-微柱LCMS/MS新技术可能提高泪液小分子化学成分的检测灵敏度和准确度，从而丰富泪液的研究手段，扩宽泪液的研究范围。