新藤黄酸体外抗肺癌血管生成的作用机制研究

朱亚芳

（河北中石油中心医院，河北 廊坊）

0 引言

据资料显示，癌症已经成为了威胁人类生命健康的主要疾病之一，其具有发病隐蔽、转移性高、复发率高、肿瘤细胞耐药强等特点，导致临床治疗困难[1-3]。为了有效的控制疾病的发展，提高患者的生活质量与生存率，急需一种有效的抗肿瘤药物。据资料显示，新藤黄酸对不同肿瘤细胞的增殖具有有效的抑制作用，能明显控制患者病情的发展，提高其生活质量和生存率[4-8]。本研究就是为了分析观察新藤黄酸对肺癌血管生成的影响以及初步的作用机制，具体结果如下。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料：选用中国科学院上海细胞库的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人肺腺癌细胞A549，以及上海源叶生物有限公司的新藤黄酸。

检测材料：胎牛血清，DMEM高糖培养基，Matrigel，胰蛋白酶，DAPI，An-NexinV-FITC/PI双 染 法 试 剂 盒，LY294002，Akt、β-actin抗体，PI3K、p-PI3K、p-Akt、VEGF，PI3K、Akt、β-actin引物，PTENsiRNA序列（上游 5’-GGCUAAGUGAAGAUGACAATT-3’和 下 游 5’-UUGU-CAUCUUCACUUAGCCTT-3’），Lipofectamine 2000TM。

仪器材料：生物安全柜、高压灭菌锅、高速立式冷冻离心机、倒置荧光显微镜、流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 新藤黄酸对HUVEC血管成管的影响

选用24孔细胞培养板，在使用前先放置4℃温度下预冷，接着将液体状态的Matrigel胶注入各孔，按照300μL/孔的规格，然后将培养板放入37℃培养箱中培养30min。最后将HU-VEC接种于用Matrigel胶覆盖的细胞培养板，按照8×104个/孔的规格，并依次加入不同浓度的培养基进行培养（37℃，5%CO2）。通过倒置显微镜于培养18h后对其的管状结构的形态进行观察记录[9-10]。

1.2.2 新藤黄酸对细胞凋亡率的影响

①将对数生长期的HUVEC接种于6孔板中，按照1×105个/孔的规格。先对其进行孵育培养，然后将旧培养液换成含1，2，4μmol·L-1GNA的条件培养液继续培养24h。接着采用不含EDTA-Na2的细胞消化液进行消化离心处理，并收集处理后的细胞。②对收集到的细胞使用4℃预冷的PBS缓冲液进行冲洗（2遍，1800r·min-1离心5min）。然后加入400μL的PBS重悬细胞、5μL的AnnexinV-FITC，并使用吹打管吹打均匀，避光培养15min后，再加入5μL的PI进行充分混合，避光培养5min后使用流式细胞仪检测。

1.2.3 新藤黄酸对蛋白表达的影响[11]

①将各组细胞消化收集后的细胞，使用PBS（4℃）进行洗涤2次，然后加入PMSF的RIPA细胞裂解液并置于冰上孵育10min，接着采用高速立式冷冻离心机进行离心分离（12000r·min-1）5min后收集上层澄清液于EP管中，最后加入LoadingBuffer后于100℃下煮10min，置于4℃下保存。②采用蛋白定量试剂盒和ECL试剂盒严格根据说明书对其进行操作。

1.2.4 PTEN-siRNA转染细胞后，新藤黄酸对PI3K，Akt基因的表达水平的影响

①在6孔板中接种细胞，按照1×106/孔的规格，然后加入不含抗生素的培养基1.8mL。从每孔中取出2μL的50μmol/LPTEN-siRNA储液，并将其溶于Opti-MEMIReducedSerumMedium中进行稀释混合。②根据Lipofectamine2000TM5μL/孔、Op-ti-MEMI ReducedSerumMedium100μL/孔的规格进行稀释混合，并放置于常温下保存5min。③将两组进行混合，并放置于常温下保存20min，然后除去旧培养基并使用不含血清培养基洗涤2次，并给每孔换上新鲜培养基1.8mL后，加入转染试剂，并于轻轻摇匀后继续培养6h。④采用流式细胞仪和biocaptMV软件，严格参照说明书对转染效率和mRNA的相对表达量进行检测。

1.3 统计学分析

使用SPSS 20.0软件做统计学结果分析。

2 结果

2.1 新藤黄酸对HUVEC血管成管的影响

倒置显微镜下发现，新藤黄酸能使得HUVEC细胞形态变成梭状，并向凝胶基质中延伸，呈现线性排列并形成管腔样结构。并且由于浓度的不同，细胞成管数不同，随着浓度的增加，细胞管腔样结构逐渐减少。

2.2 新藤黄酸对细胞凋亡率的影响

流式细胞仪结果显示，细胞凋亡率在GNA的1、2和4μmol/L浓度下分别为（4.5±1.9）%，（9.2±2.4）%，（30.5±6.4）%，与空白对照组（0.21±0.02）%相比具有明显差异（P＜0.05）。

2.3 新藤黄酸对蛋白表达的影响

HUVEC的p-PI3K，p-Akt蛋白表达量随着GNA药物浓度的增加而下降，但蛋白PI3K表达量基本不变。当PTEN-siRNA转染细胞后，结果显示经GNA作用后PI3K，AktmRNA基因的表达水平明显高于空白对照组（P＜0.05）。

3 讨论

藤黄（gamboge）为藤黄科植物藤黄Garcinia hanbaryi Hook.f.的树干被割伤后流出的胶状树脂[12-14]。近20年来，对藤黄及其活性成分藤黄酸等做了大量的研究工作，发现藤黄具有抗癌作用，并经多次实验重复证明其主要的有效成分是以藤黄酸（gambogic acid）为代表的桥环化合物，其抗癌作用与一般的化疗抗癌药有所区别，能选择性地杀死癌细胞，而对正常的造血系统和白细胞没有影响[15]。1984年吕归宝从中药藤黄中分离得到新藤黄酸，根据目前研究表明，新藤黄酸与藤黄酸相比具有作用强，毒性低、稳定性好和抗癌谱广等特点。

VEGF是目前所知最强的、直接作用于血管内皮细胞的血管生成促进因子。普遍认为VEGF是肿瘤血管生成的一个关键调节者。VEGF是内皮细胞上特异性的有丝分裂素，与其受体Flt-1和KDR/Flk-1选择性位于血管内皮细胞上，激活VEGF和其受体皆可促进内皮细胞的有丝分裂，刺激血管生成的全过程，增强微血管通透性。

实验结果显示，中药藤黄中含有新藤黄酸对肺腺癌A549细胞具有较强的增殖抑制作用，能有效的诱导A549细胞发生凋亡及抑制细胞自噬，并且还具有抑制血管生成的作用（抑制效果与剂量有关）和抑制p-PI3K，p-Akt蛋白的表达水平的作用。当PTEN-siRNA转染入细胞后，能促进PI3K，AktmRNA基因的表达与空白对照组相比（P＜0.05）。

综上所述，新藤黄酸具有抑制内皮细胞的小管形成和诱导内皮细胞凋亡的作用，能有效的阻断肿瘤血管生成中的重要环节。其具有的抑制内皮细胞小管形成和诱导细胞凋亡的机制可能与PI3K/Akt信号通路有关。