人子宫平滑肌瘤原代细胞培养方法的建立和优化

韦 超 李冬华* 钱睿亚 刘 宇 王文娜 邱甜甜 任 慧

(1.首都医科大学中医药学院，北京 100069；2.首都医科大学附属北京妇产医院妇四病房，北京 100026)

子宫肌瘤是一种常见的良性妇科肿瘤，多发生在育龄期女性，与雌激素浓度密切相关[1-3]。本病发病率高，大多数患者临床症状不明显，一般随着年龄增长，雌孕激素浓度的下降，可自行萎缩，但有部分患者子宫肌瘤过大或者生长过快，症状明显可能出现经血增多及其引起的贫血，过大的子宫肌瘤产生压迫症状如便秘、尿潴留、腰痛，甚至流产，影响受孕，严重影响女性的正常生活[4-7]，极少数患者向恶性肿瘤转化[8]。目前临床上尚缺乏有效的药物治疗，一般单发性肌瘤超过5 cm或者多发出现明显症状者建议手术治疗[9-13]。

体外研究模型的发展极大地促进了细胞代谢、增生、凋亡的研究，促进了人们对疾病机制深入认识和了解，很大程度地促进了医学的发展[14]。体外实验模型建立方法是开展一切体外实验的基础，体外模型的质量决定了研究结果的真实性、可靠性和稳定性，因此体外培养模型的建立和质量控制对疾病的研究至关重要。原代细胞刚刚离体，组织学特性、生物学特性及遗传特性都接近于体内，适合药物研究、分子机制研究、细胞分化研究等[15]。本研究基于消化法建立子宫肌瘤细胞原代培养方法并通过系列实验对时间点探索进行培养方法的优化，为子宫肌瘤体外实验研究奠定方法学基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

I型胶原酶(美国Gibco公司)，DMEM-F12培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(美国Gibco公司),70 μm细胞筛(美国BD公司)，0.25%(质量分数)-EDTA的胰酶(美国Gibco公司)，细胞爬片(美国Meilunbio公司)，山羊血清(中国碧云天公司)，Triton X-100(中国索莱宝公司)，小鼠抗人平滑肌肌动蛋白α(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)，单克隆抗体(美国Abcam公司)，FITC标记的荧光二抗(中国中山金桥公司)。

1.2 原代细胞的提取

1.2.1 组织来源

随机选取经首都医科大学附属北京妇产医院诊断子宫肌瘤且未经药物治疗需行子宫平滑肌瘤剔除术的患者，本研究获得所有患者知情同意并经笔者医院伦理委员会审核，伦理审批号：IEC-B-03-V01-FJ1。经术后病理诊断确诊为子宫肌瘤，取剔除部分新鲜的肿瘤组织，迅速放入含3%(质量分数)青/链霉素不含胎牛血清的冰浴DMEM-F12培养基中，封闭，迅速取回。

1.2.2 细胞提取

将组织块取出，用含1%(质量分数)青/链霉素的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)反复漂洗3次，剥离最外层包膜和最内层的中心缺血区，留取中间部分，用眼科剪将组织块剪成1 mm3的组织碎块，按照体积比1∶10加入0.2%(质量分数)I型胶原酶，放入37 ℃水浴，并间断混匀，进行组织块消化。分别在消化4、8、12、16、20和24 h后，用70 μm的细胞筛过滤细胞，将过滤出的细胞悬液1 200 r/min离心10 min。弃上清，加入完全培养基[包含10%(体积分数)FBS和1%(质量分数)青/链霉素的DMEM-F12培养基]，吹打混匀细胞悬液加入细胞培养瓶中，放入5%(体积分数)CO237 ℃培养箱中培养，待细胞密度达到80%融合，用0.25%(质量分数)-EDTA的胰酶消化，传代培养。

1.3 α-SMA免疫荧光细胞鉴定

将培养到第 4代状态稳定后的子宫平滑肌瘤细胞，用含DMEM-F12完全培养基制备细胞悬液，接种于放置细胞爬片的24孔细胞培养板中，放入5%(体积分数)CO237 ℃培养箱中培养12 h；细胞贴壁后，加入完全培养基1 mL继续培养24 h，取出培养板 PBS 漂洗3次，每次3 min。用4%(质量分数)多聚甲醛室温固定20 min，PBS 漂洗3次，每次3 min。0.3%(体积分数) Triton X-100 室温下破膜20 min，PBS漂洗3次。用10%(体积分数)山羊血清的PBS，37 ℃封闭30 min；10%(体积分数)山羊血清稀释的一抗α-SMA抗体(1∶200)放置4 ℃孵育过夜；37 ℃复温30 min，用PBS漂洗3次，每次5 min；加入10%(体积分数)山羊血清稀释的FITC标记的山羊抗鼠(1∶200)，37 ℃避光孵育1 h，PBS 漂洗3次，每次5 min；向细胞爬片上滴加50 μL DAPI 染核5 min，PBS漂洗3次，每次5 min；用抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察并拍照。

2 结果

2.1 培养48 h镜下细胞密度和状态

胶原酶消化组织块4、8、12、16、20和24 h分别37 ℃ 5%(体积分数)CO2，95%湿度的培养箱中培养48 h，观察拍照细胞密度和状态。在胶原酶消化组织块4h，细胞密度较低，随着时间延长细胞密度增加，消化16 h细胞密度最大，之后20 h和24 h细胞密度下降。如图显示以I型胶原酶消化16 h获取的细胞数目最多。培养48 h细胞可见：细胞均贴壁生长，基本形态呈梭形或分枝状(图1)。

图1 组织消化不同时间点提取的原代子宫平滑肌瘤细胞(10×)Fig.1 Primary uterine leiomyoma cells extracted at different time points with tissue digestion methods

2.2 培养7 d镜下细胞密度和状态

光学显微镜下观察，可以看到高密度细胞生长速度快，培养7 d，细胞基本均匀平铺铺满，细胞排列规整紧密，条束状；低密度细胞生长速度较慢，7 d可见细胞分枝状、不规则状，细胞空间充足，单个细胞伸展体积大，胞质丰富(图2)。

图2 不同密度肌瘤细胞培养7 d形态特征Fig.2 Morphological characteristics of HuLM cells with different densities cultured for 7 daysHuLM： human uterus leiomyoma.

2.3 培养12 d镜下细胞密度和状态

光镜下观察，当细胞密度达到完全融合后，细胞未表现出显著的接触抑制，表现为规则呈簇的平铺叠层束状生长，部分细胞单层排列，部分细胞多层重叠呈整齐的束状带排列，整体上表现出典型的峰谷状。作为良性肿瘤，细胞接触抑制不显著，当细胞铺满后，营养成分的匮乏，单层细胞区首先出现生长抑制，多层细胞束状带继续维持束状生长，这与子宫肌瘤体内生长特性及其类似(图3)。

图3 培养12 d细胞形态特征Fig.3 Morphological characteristics of HuLM cells with different densities cultured for 12 daysHuLM： human uterus leiomyoma.

2.4 免疫荧光α-SMA细胞鉴定

高倍镜和低倍镜下均观察到所有细胞的DAPI染细胞核和α-SMA染色细胞能全部拟合，所有的细胞均为子宫平滑肌瘤细胞(图4)。

图4 光学显微镜下免疫荧光检测细胞α-SMA表达Fig.4 Detection of α-SMA expression in HuLM cells by immunofluorescenceα-SMA： alpha-smooth muscle actin;HuLM： human uterus leiomyoma.

3 讨论

医学研究中很多至关重要的实验无法在人体内进行，体外原代细胞培养弥补了这一缺陷。子宫肌瘤是单克隆肿瘤，取材来自单发的肌瘤组织，获取的原代子宫肌瘤细胞，成分单一，离体时间短，具备体内生理状态下细胞的结构和功能，体外培养环境稳定，消除了神经、体液及激素等因素的影响等优点，因此获取子宫肌瘤原代细胞进行体外实验，在研究子宫肌瘤的发病机制、新药研发及药物作用机制等方面都有很好的应用价值[16]。

子宫平滑肌瘤原代细胞存在培养和纯化困难等问题，影响子宫平滑肌瘤体外实验研究。研究[17-18]显示，子宫肌瘤细胞的原代细胞的常用的获取方法有组织块贴壁法和消化法，采用组织块贴壁法，需要1个月长出第一代，存在耗时长，污染风险大等问题，不能满足实验基本需求，本研究未涉及。胶原酶消化法周期短，获取细胞数目多，本研究针对消化法进行原代细胞获取方法的实验探索。消化法获取细胞的关键是胶原酶的消化时间，常用Ⅰ型胶原酶或Ⅱ型胶原酶消化4、6、13 h不等[19-21]。本研究采用Ⅰ型胶原酶对子宫肌瘤组织的消化时间进行了系列实验对子宫肌瘤的细胞获取的消化条件，最佳消化时间进行探索。实验结果表明在消化的2 h内未取到细胞，在4 h内获取少量的子宫平滑肌瘤细胞，并且含有很多未消化完全的絮状物，随着消化时间延长获取的细胞数增多，至16 h胶原酶消化的组织悬液，未见黏有絮状物，获取的细胞数达到最多，在消化20 h和24 h，获取细胞数明显减少，可能是由于胶原酶对细胞的消化损害，导致细胞数目减少。由此，可得出结论，用0.2%(质量分数)的Ⅰ型胶原酶对子宫平滑肌瘤组织消化，在组织和胶原酶体积比1∶10情况下，获取原代子宫肌瘤细胞的最佳消化时间是16 h。

原代细胞源自刚刚离体的组织，由于机体组织的复杂性，提取的细胞往往含有组织纤维结构、血管等成分，原代细胞的纯化是一大挑战。只有细胞纯度达到95%以上才能保证细胞稳定传代、生物学特性稳定性、实验可重复性，才能进行后续实验研究[18]。本研究用肌瘤组织提取细胞中含杂细胞较多，可能混合血管内皮细胞、成纤维细胞、血细胞等，血细胞不贴壁，内皮细胞和成纤维细胞用0.25%(质量分数)EDTA的胰酶很容易消化下来，肌瘤细胞贴壁牢固，消化时间长3～5 min，早期消化下来的细胞受到胰酶的损害，细胞状态差，经反复传代培养，子宫肌瘤细胞得到纯化。子宫肌瘤细胞属于平滑肌细胞，能特异性表达α-SMA[22]，本研究采用抗平滑肌细胞特异性抗体抗α-SMA抗体，用免疫荧光技术进行细胞鉴定，结果显示，实验获取的子宫肌瘤细胞纯度高达到95%以上，几乎不含杂细胞，满足实验要求及后续研究的应用，说明采用差速消化法可将杂细胞去除。

体外实验需要在适宜的环境生长，本身受到各种不同于体内因素的干扰。作为原代细胞，由于其体外培养有自身的局限性而且随着传代时间延续，细胞结构和生物学特性可能发生变化[23]，而细胞研究对细胞培养的状态和稳定性有很高的要求，在细胞最佳状态下的实验研究才有意义。细胞状态和生长周期密切相关，鉴于良性肿瘤和恶性肿瘤的显著差异，及原代细胞和细胞系的显著区别，本研究针对原代良性肿瘤细胞的获取方法进行优化，并对这一优化方法培养的细胞进行不同时间细胞状态和形态学特征分析，为后续实验的继续培养提供参考依据。

关于子宫肌瘤原代培养的文献[20-23]报道很多，但如何获得数量多、纯度高的子宫肌瘤细胞仍是关键问题。本研究经过一系列实验、观察，对人子宫肌瘤原代细胞的分离与培养的方法进行了探索，总结出一种稳定可靠的子宫肌瘤原代细胞培养方法。通过对子宫肌瘤细胞的体外培养方法探索，优化了子宫肌瘤原代细胞的培养和纯化方法，培养出数量多、纯度高的子宫肌瘤细胞，并对细胞不同状态的形态特征进行描述，为子宫肌瘤细胞进一步研究提供了实用的实验方法和可靠的参考依据。