新型冠状病毒核酸检测试剂盒产品的分析与评价

李 达，杨 忠，2，王 军，2，王会如，2*

（1.北京市医疗器械检验所，北京101111；2.医疗器械检验与安全性评价北京市重点实验室，北京101111）

0 引言

2020 年1 月，研究人员经过病毒分离并测序不明原因肺炎患者的样本发现了一种区别于中东呼吸综合征（middle east respiratory syndrome，MERS）和严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）的新型冠状病毒[1]。中国卫生健康委员会将其命名为新型冠状病毒，随后国际病毒分类学会将其命名为SARS-CoV-2[2]。该病毒传染性强、传播途径隐蔽、传播速度快。根据世界卫生组织统计，2020 年7 月全球患新型冠状病毒肺炎（以下简称“新冠肺炎”）的确诊患者超过150 万，累计死亡6 万余人[3]。

为有效预防、及时控制和消除新冠肺炎疫情，确保突发公共卫生事件应急所需医疗器械，截至2020年6 月，经国家药品监督管理局批准获得注册证的SARS-CoV-2 检测试剂产品已达45 种。其中，核酸检测试剂产品24 种，占比53%，其产地主要分布在上海市、武汉市、北京市等10 个省市。

核酸检测作为临床检验的重要方法，现已是SARS-CoV-2 的首选检测技术。核酸检测相较于传统的病毒分离检测，具有耗时短、操作简单、实验条件较低、稳定性好等多个优点；相较于常规的抗原和抗体检测，具有灵敏度和特异度高、不存在窗口期且不容易被干扰等优势。荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）在核酸检测中因其很高的灵敏度和特异度、高检测通量、操作简单的优点与测序技术一起作为确诊标准被写入《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》[4]。目前，已获得医疗器械注册证的荧光定量PCR 法SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒产品有17 种，占比71%，是主力检测产品。本文从产品性能、临床实验验证和SARS-CoV-2 核酸检测评价物质3 个方面介绍并分析市场占有率较高的10种荧光定量PCR 法SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒产品的特点，以期为SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒产品的评价提供参考与借鉴。

1 产品性能

目前，注册上市的10 种SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒产品概况详见表1。表1 从适用临床样本类型、检测基因位点、上样量大小以及阈值判断等方面展示了各产品的特点。

1.1 核酸提取

表1 SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒产品概况

从表1 中可以看出，试剂盒检测的样本主要包括口咽拭子、鼻咽拭子、痰液和肺泡灌洗液4 种类型。根据文献报道[5-7]，4 种类型样本含有的病毒载量有所差异。广东省疾病预防控制中心与中山大学团队通过分析17 例新冠肺炎患者，发现鼻腔中的病毒载量高于咽喉[5]；首都医科大学附属北京地坛医院对31 例新冠肺炎患者检测，发现痰液标本的病毒载量高于咽拭子标本，检测效果优于咽拭子[6]。根据《新型冠状病毒肺炎病毒核酸检测专家共识》描述，标本采集优选顺序为鼻咽拭子、口咽拭子、痰液，而对于气管插管的重症患者才会采用肺泡灌洗液样本[7]。因此，SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒可满足多种类型的临床样本检测，具有重要作用。

SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒除北京纳捷诊断试剂有限公司产品外均需要配套核酸提取试剂盒，而病毒核酸的提取效率和质量好坏直接影响检测试剂盒的判读。马雯等[8]通过实验比较6 种不同品牌的SARS-CoV-2 核酸提取试剂盒，发现各品牌之间的提取效率和纯度差异显著。因此，选择配套的病毒核酸提取试剂盒产品非常必要。目前，临床实验中核酸自动提取仪基本取代了人工提取[9]。然而，已注册SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒中很少配套全自动核酸提取试剂盒。

1.2 检测靶点

SARS-CoV-2 是一种单股正链RNA 病毒，属冠状病毒科β 冠状病毒属中的Sarbecovirus 亚属。其基因组包含11 个基因，序列大小约29 882 nt，如图1 所示。其中功能较为重要的5 个基因分别是orf1ab含有的rdrp 基因、s 基因编码刺突蛋白、e 基因编码囊膜蛋白、m 基因编码膜蛋白、n 基因编码核蛋白。根据SARS-CoV-2 核酸序列特点，我国疾病预防控制中心推荐的检测基因为orf1ab 基因和n 基因，而美国疾控中心检测的基因为n 基因，世界卫生组织推荐的检测基因为orf1ab 基因、n 基因和e 基因。从表1 中可以看出，10 种SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒的靶基因基本为orf1ab 基因和n 基因，仅有3 种检测试剂盒中增加了e 基因，而1 种检测试剂盒中只有orf1ab 一个靶基因。

图1 SARS-CoV-2 基因结构图

国家生物信息中心对基于人体提取的65 株病毒全基因组序列进行分析，发现SARS-CoV-2 群体内的序列变异主要发生在5 个基因上，即s 基因、n 基因、orf8 基因、orf3a 基因和最大的orf1ab 基因[10]。其中，orf1ab 基因位点变异点数高达39 个。经分析，约42%的变异是非同义突变，且发现多株病毒的非同义突变主要发生在s 蛋白的第32 位和第49 位及orf8 蛋白的第84 位[10]。典型的RNA 病毒平均进化速率为10-4nt/a，随着基因组循环复制发生突变[11]。因此，荧光定量PCR 法检测SARS-CoV-2 有可能因为病毒株核酸序列变异产生假阴性结果。目前，临床检测SARSCoV-2 经常出现单靶点阳性结果。分析原因，可能是双靶点试剂盒中n 基因扩增灵敏度高于orf1ab 基因；也有报道称病毒n 基因转录出的mRNA 数量远高于orf1ab 基因，在病毒RNA 拷贝数未达到试剂盒的检测限时，容易造成单靶点阳性[12]。另外，不同试剂盒设计的基因位点不同，导致其他冠状病毒的orf1ab 基因被扩增。因此，试剂盒设计多个靶基因和位点检测能有效降低漏检和错检概率，提高试剂盒检测的准确性。

经核酸序列分析发现，SARS-CoV-2 与2002 年暴发于我国广东省的重症急性呼吸综合征（SARSCoV）和2012 年暴发于沙特阿拉伯的中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）具有较高的遗传相似度，分别为79%和50%[13]。如图2 所示，利用MEGA 7 软件[14]聚类分析，发现SARS-CoV-2 与HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63 和HCoV-HKU1 4 种冠状病毒[15]也具有一定的相似度，但与甲型流感病毒（influenza A virus，Flu A）序列相似度差异较大。根据国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心发布的《2019 新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点》，交叉反应验证除检验以上6 种冠状病毒和Flu A 外，还需检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒、鼻病毒等14 种病毒，军团菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌等12 种致病菌以及衣原体和支原体等。虽然SARSCoV-2 核酸序列与上述病毒、致病菌差异较大，但SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒作为核酸类检测试剂盒，验证交叉反应是临床检验的必要步骤。同时，还需考虑干扰因素的影响，如黏蛋白、血液、鼻腔喷雾剂或滴剂，其中可能含有的皮脂固醇、过敏症缓解药物、抗病毒药物、抗生素等是否会干扰试剂盒的判读结果。

图2 SARS-CoV-2 相关核酸序列聚类关系图

1.3 阈值判断

荧光定量PCR 法是在DNA 扩增反应中，检测每次PCR 循环后荧光产物总量，将反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，即Ct 值作为核酸检出的判断阈值的方法[16]。Ct 值作为阳性阈值的判断值，是SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒最重要的核心参数之一。PCR 反应的原理主要是模板变性、引物结合、引物延伸3 个步骤反复循环。每循环一次，模板数增加1 倍或接近1 倍[17]。随着扩增周期的增加，有限次循环内，模板以指数方式进行增长。每一次扩增后产物的量可以用YCt表示，计算公式如下：

式中，YCt表示荧光信号达到阈值时扩增产物的量；N表示初始模板量；E 表示扩增效率。

两边取对数后，公式变形为

图3 不同扩增效率下荧光定量PCR 检测靶标分子数目与Ct 值关系图

假设扩增产物量达到1×1012分子拷贝数（copies）时，达到设定阈值。根据公式（2）绘制3 种扩增效率下检测靶标分子数目与Ct 值的关系图，如图3 所示。可以看出，在靶标分子数目较少时，Ct 值有较大的区分度。例如，样本的靶标分子数为1 和10 时，它们对应的Ct 值分别为39.86 和36.54，相差3.32；而靶标分子数为101 和110 时，对应的Ct 值分别为33.20 和33.08，相差仅0.12。当扩增效率分别为80%或120%时，Ct 值相应增加或减少，但其变化趋势一致。因此，10 家SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒产品的Ct 值从36 到43 不等可能是由于荧光定量PCR 法所用的探针、引物、反应酶和反应液不同，造成靶基因扩增效率不同而引起的。

检测限一直是分子诊断产品的重要指标，检测限设置较低容易造成假阳性，设置过高容易造成假阴性[18]。由表1 可知，10 种SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒的检测限为100~1 000 copies/mL。因此，在弱阳性样本的判读上，不同SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒产品可能会得出不同结论。检测限指标需要可溯源的病毒拷贝数来验证，保证统一的量值才能正确地分辨产品的检测下限。而SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒利用荧光定量PCR 法检测，其检测限一般设定在1~10 个分子靶标之间。对于没有灰区设置的SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒，当检出的Ct 值与判断阳性阈值的Ct 值的差小于3 时，建议进行重复实验，以排除假阳性或假阴性的可能。

2 临床实验验证

由于疫情发展迅速，对不同程度临床症状患者和疑似患者进行诊断需要快速有效的方法，而SARSCoV-2 核酸检测可为诊断提供直接证据。在目前最新版本的诊疗方案中，SARS-CoV-2 核酸检测仍是唯一确诊依据[19]。根据SARS-CoV-2 核酸检测试剂临床试验要求，目前已上市试剂盒产品考核试剂与对比试剂阳性符合率均在90%以上，阴性符合率在88%以上[20]。虽然试剂盒产品经过了严格的临床试验，但由于新冠肺炎是新发疾病，SARS-CoV-2 核酸检测技术还缺乏大量的科学数据支撑，所以实验室评价不同产品之间的性能成为了各医院检验科和临床检验机构必不可少的环节。

河南省疾病预防控制中心通过检测47 份临床样本，对6 种试剂盒产品的阳性检出率进行评价，得出6 种产品阳性检出率差异不大、稳定性较好的结论[21]。但梯度稀释阳性样本后，发现1 种试剂盒检出率较低，且不能同时检出orf1ab 和n 基因阳性。湖北省鄂州市医院检验科采用40 例新冠肺炎确诊病例和16 份非新冠肺炎住院患者的咽拭子样本对3 种SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒分析了敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和Kappa 值，得出不同厂家生产的SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒的判读结果存在差异的结论[22]。深圳市罗湖区人民医院和深圳大学第三附属医院利用10 份SARS-CoV-2 核酸阳性样本进行梯度稀释评价了7 种国内上市的SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒，得出7 种试剂盒对病毒载量较高的阳性样本的检测准确度和重复性无明显差异，但对弱阳性样本的检出能力欠佳的结论[23]。上海临床检验中心利用一步法反转录数字PCR 平台对上市的6 种SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒进行了病毒拷贝数检测限评价，结果显示不同试剂盒核酸拷贝数检测限差异明显，得出试剂盒的检测限水平可能是导致假阴性结果的重要原因[24]。

对各临床检验机构开展的试剂盒性能评价试验进行整理，验证多种试剂盒检测结果的一致性，可以有效对比产品之间的差异。从上述几家临床机构的实验结果可以看出，不同厂家检测试剂盒对病毒载量较高的阳性样本的检测结果具有较好的一致性，但对弱阳性样本的判断结果存在较大差异。

3 SARS-CoV-2 核酸检测评价物质

目前，用于评价SARS-CoV-2 核酸检测质量的物质大致分为质粒、RNA、假病毒、临床样本和SARSCoV-2 病毒等。表2 介绍了SARS-CoV-2 核酸检测评价物质各自的优缺点。

表2 5 种SARS-CoV-2 核酸检测评价物质的优缺点

质粒作为核酸信息准确、构建方便、定量准确的载体，首先被用作检测试剂盒的评价物质。然而，质粒是环状DNA 结构，不能有效证明RNA 逆转录扩增效率，存在缺陷。通过体外转录或合成RNA 虽然能够模拟RNA 病毒的核酸信息，真实模拟逆转录反应过程，但转录或合成RNA 长度受到限制，并且RNA 保存非常不稳定。假病毒是携带病毒核酸的质粒转染进细胞内转录出病毒RNA 并包入病毒样颗粒的物质，类似SARS-CoV-2 病毒。假病毒真正做到了从样品处理到扩增的全程质量检测。然而，假病毒携带的病毒核酸片段较短，不是完整的病毒核酸，制约了假病毒在评价SARS-CoV-2 核酸检测方面的应用。有研究利用转化偶联重组技术，将SARS-CoV-2反义DNA 片段通过酿酒酵母中的同源重组系统，将十几个片段重组成完整的基因序列，然后在体外转录成病毒RNA，通过电穿孔将RNA 导入细胞并复制包装[25]。可见，假病毒未来具有较好的应用前景。临床样本作为评价物质是最有效的评价，然而，临床样本来源有限且背景复杂，不能稳定持续提供。SARSCoV-2 病毒作为评价物质可以稳定持续提供，病毒的获得可以利用SARS-CoV-2 感染敏感细胞Vero E6 或Huh-7 培养获得可稳定复制的病毒细胞感染模型[26-27]，从而得到纯度高、稳定性好的病毒样本。但该实验操作需要在生物安全防护三级实验室内进行，且分离病毒过程十分复杂，培养的病毒还需要经过灭活处理后才可使用，因此可能存在一定的生物安全风险。另外，培养的病毒与临床样本中的病毒基质不同，病毒提取效率有可能存在差异。

根据研制单位和使用领域的不同，SARS-CoV-2核酸检测评价物质又被称为标准物质、参考品、标准品和质控品等，评价物质来源的多样化为试剂盒产品评价和实验室质量控制提供了保障。在计量领域，中国计量科学研究院开发了SARS-CoV-2 核酸检测标准物质，利用体外转录RNA 混合物，包括核壳蛋白n 基因全长、包膜蛋白e 基因全长、orf1ab 基因片段[28]。该标准物质涵盖了世界卫生组织与中国疾病预防和控制中心推荐的全部检测区段，标准值为3个基因的拷贝数浓度。上海市计量测试技术研究院利用体外转录技术研发的SARSCoV-2 RNA 标准物质，同样含有核壳蛋白n 基因全长、包膜蛋白e 基因全长、orf1ab基因片段，并通过了9 种SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒的评价[29]。中国食品药品检定研究院通过与武汉某医院合作，利用灭活临床样本提取RNA，制作了SARS-CoV-2核酸检测试剂国家参考品，含有7 种阳性参考品、21种其他致病菌阴性参考品、1 种稀释用的灵敏度参考品和1 种精密性参考品[30]。国家卫生健康委员会临床检验中心开展全国SARS-CoV-2 核酸检测室间质量评价活动，利用基因工程方法制备的噬菌体病毒样颗粒模拟样本，无生物传染危险性，保证了标准品与临床样本有较好的一致性[31]。欧盟委员会联合研究中心发布了用于qRT-PCR 法检测SARS-CoV-2的RNA 溶液质控品[32]。该质控品为合成的单链RNA，涵盖了美国、德国、日本和菲律宾疾控中心建议的靶点序列。另外，大量的商业化SARS-CoV-2 假病毒标准品也涌入市场，弥补了SARS-CoV-2 核酸检测评价物质供应量的需求。

4 结语

本文仅对目前临床上使用最多的荧光定量PCR法SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒产品进行了评价分析，描述试剂盒产品的性能特点和技术指标，并解读产品的关键指标。同时，总结了临床评价多种试剂盒的方法，指出检测限水平是造成产品存在差异的主要原因。最后，总结并分析了5 种SARS-CoV-2 核酸检测评价物质，指出其各自的优缺点，为临床使用者和检验机构评价产品性能提供参考。

随着新冠肺炎防治的常态化，SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒产品种类在不断增加，如基于测序技术、基因芯片技术、等温扩增技术、数字PCR 技术和基因组编辑检测技术等技术的产品将不断地涌入市场。因此，不同产品的临床样本比对实验和核酸评价标准物质的应用，将会成为评估产品性能和质量的重要方法。希望本文能够为SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒产品的评价方法提供思路和借鉴意义。